TDX/TDR - Departament d'Enginyeria Química

Inmovilización de transaminasas y amonio liasas y su aplicación en síntesis de compuestos aminados

Tue, 26 Feb 2013 14:43:28 GMT

Inmovilización de transaminasas y amonio liasas y su aplicación en síntesis de compuestos aminados Cárdenas Fernández, Anthony Max El objetivo del presente trabajo de tesis es establecer métodos biocatalíticos para la síntesis de los aminoácidos L-fenilalanina, L-aspartato, β−aminobutirato y de las aminas aromáticas 1-feniletilamina y 3-amino-1-fenilbutano, usando biocatalizadores con actividad transaminasa y amonio liasa inmovilizados por técnicas de formación de enlaces covalentes (en el caso de enzimas) y por atrapamiento (tanto para enzimas como para células). Se establecieron dos métodos enzimáticos para la síntesis del aminoácido aromático esencial L-fenilalanina (Phe). El primer método de síntesis se realizó usando como biocatalizador L-aspartato transaminasa (AAT) de corazón porcino inmovilizado. Se optimizaron los métodos de inmovilización de AAT en los soportes Eupergit® C, MANA-agarosa y LentiKats®. Los biocatalizadores inmovilizados resultantes se emplearon en la síntesis de Phe. La inmovilización en Eupergit® C y LentiKats® permitió mejorar la estabilidad del enzima AAT, así como alcanzar rendimientos de reacción de síntesis de Phe superiores al 70%. Además se estableció un método de síntesis multienzimática “one-pot”, para lo que se acoplaron las reacciones catalizadas por los enzimas aspartasa (AspB) y transaminasa (AT). Se determinó la compatibilidad de los enzimas en las condiciones de reacción (pH 7,5 y 37°C) y se establecieron las concentraciones óptimas de los sustratos (0,15 M de fumarato, 0,3 M de NH4Cl y 0,1 M de fenilpiruvato) y de los enzimas (0,3 U de AspB/mL y 2 U de AT/mL). En estas condiciones, se alcanzó un rendimiento global de reacción de 80%. Para la síntesis de L-aspartato (Asp) se utilizó el enzima L-aspartato amonio liasa o aspartasa (AspB) de Bacillus sp. YM55-1 parcialmente purificado. El enzima se inmovilizó en los soportes Eupergit® C, MANA-agarosa y LentiKats®. Los biocatalizadores inmovilizados se emplearon en la síntesis de altas concentraciones de Asp (≥ 60 g/L). Además, el enzima inmovilizado se reutilizó eficientemente en la síntesis del aminoácido, manteniendo alrededor del 90% de su actividad inicial al cabo de 5 ciclos de reacción en todos los casos. La síntesis de las aminas aromáticas 1-feniletilamina (FEA) y 3-amino-1-fenilbutano (AFB) se llevó a cabo utilizando biocatalizadores (células y/o enzima parcialmente purificado) con actividad ω−transaminasa (ω−TA). Se estableció un método de permeabilización de las membranas de células ω−TA utilizando bromuro de cetrimonio (CTAB). Las células ω−TA se inmovilizaron en el soporte LentiKats® con un 100% de retención de su actividad catalítica. El enzima ω−TA se inmovilizó en varios soportes, obteniéndose los mejores resultados en Eupergit® CM y LentiKats®. La inmovilización en LentiKats®, tanto de células (no permeabilizadas y permeabilizadas) como del enzima, permitió la reutilización de los catalizadores hasta en 5 y 10 ciclos de síntesis de AFB, manteniendo alrededor del 80 y 70% de la actividad inicial, respectivamente. Por último, se comprobó que el enzima aspartasa mutado (AspB-C6) a partir de AspB, cataliza la reacción de aminación regioselectiva del ácido crotónico para producir β−aminobutirato. Este enzima se inmovilizó en los soportes Eupergit® C y MANA-agarosa según los métodos de inmovilización establecidos para el enzima AspB en los mismos soportes. Se obtuvieron rendimientos de inmovilización similares pero las actividades retenidas fueron significativamente inferiores para AspB-C6 que para AspB.; The objective of this thesis is to establish biocatalytic methods for the synthesis of the amino acids L-aspartate, L-phenylalanine and β−aminobutyrate, as well as the aromatic amines 1-phenylethylamine and 3-amine-1-phenylbutane, by using biocatalysts with transaminase and ammonia-lyase activity immobilized by covalent attachment techniques (for enzymes) and entrapment (for enzymes and cells). Two methods for the synthesis of the essential aromatic amino acid L-phenylalanine (Phe) were established. The first method was carried out by using L-aspartate transaminase (AAT) from porcine heart as biocatalyst. The immobilization of the enzyme AAT on Eupergit® C, MANA-agarose and LentiKats® supports was optimized, and the three immobilized enzymatic derivatives were used for the synthesis of Phe. AAT immobilized on Eupergit® C and LentiKats® allowed improving the stability of the enzyme as well as reaching reaction yields of Phe over 70%. Moreover, a multi-enzymatic one-pot method for the synthesis of Phe was established by coupling of two consecutive enzymatic reactions catalyzed by aspartase (AspB) and transaminase (AT). The compatibility of both enzymes under the reaction conditions (pH 7,5 and 37°C) was shown; and, the optimum concentration of substrates (0,15 M fumarate, 0,3 M NH4Cl and 0,1 M phenylpyruvate) and enzymes (0,3 U of AspB/mL and 2 U of AT/mL) were established. In these conditions, the global reaction yield was 80%. L-aspartate was synthesized by using the enzyme L-aspartate ammonia-lyase or aspartase (AspB) from Bacillus sp. YM55-1. The enzyme was immobilized on Eupergit® C, MANA-agarose and LentiKats® supports. The immobilized biocatalysts were used for the synthesis of highly concentrated Asp (≥ 60 g/L). Furthermore, the immobilized biocatalysts were efficiently reused in 5 cycles of Asp synthesis, maintaining over 90% of activity and reaching over 90% of conversion in all the cases. The synthesis of the aromatic amine 3-amine-phenylbutane (APB) was carried out by means of cells with ω−transaminase (ω−TA) activity as well as the partially purified enzyme ω−TA. A permeabilization method of the cell membranes with cetrimonium bromide (CTAB) was performed. Cells were immobilized in LentiKats® with 100% retention of the catalytic activity. The enzyme ω−TA was immobilized on several supports, and the best results were obtained with Eupergit® CM and LentiKats® supports. The cells (non-permeabilized and permeabilized) and the enzyme immobilized in LentiKats®, allowed reusing the biocatalysts up to 5 and 10 cycles of synthesis of APB, maintaining around 80 and 70% of the initial activity respectively. Finally, it was shown that the mutated aspartase (AspB-C6) from AspB, catalyzes the regioselective amination of crotonic acid to yield β−aminobutyrate. This enzyme was immobilized on Eupergit® C and MANA-agarose supports, according to the immobilization methods established for AspB on the same supports. The immobilization yields were similar; however the retained activities were lower than those obtained for AspB.

Caracterización, inmovilización y aplicación en biocatálisis de la lipasa de Rhizopus oryzae expresada en Pichia pastoris

Thu, 20 Dec 2012 08:19:40 GMT

Caracterización, inmovilización y aplicación en biocatálisis de la lipasa de Rhizopus oryzae expresada en Pichia pastoris Guillén Montalbán, Marina En el presente trabajo se han determinado las propiedades de la lipasa recombinante de Rhizopus oryzae contenida en un extracto proteico obtenido mediante el cultivo de Pichia pastoris (rROL). Posteriormente, se ha estudiado la inmovilización de la lipasa recombinante en soportes de diferente naturaleza, como son el polvo de polipropileno (EP100) y el Eupergit®. Con el objetivo de realizar una comparación, se realizaron los mismos estudios de caracterización e inmovilización con la lipasa nativa contenida en un extracto proteico obtenido del cultivo de Rhizopus oryzae (nROL). Los análisis de caracterización revelaron dos isoformas de la lipasa recombinante con idéntico N-terminal y con masas muy similares. Por otra parte, el extracto nativo mostró tres isoformas de nROL. En cuanto a los estudios de especificidad frente a triacilglicéridos, se determinó un comportamiento igual de nROL y rROL, mientras que con los análisis frente a ésteres de p-nitrofenol se dedujo la presencia de la esterasa en el extracto nativo. En los estudios de inmovilización, tanto nROL como rROL fueron hiperactivadas a ciertas relaciones de actividad ofrecidas por miligramo de soporte. Además, la estabilidad en función de la temperatura y el pH reveló que nROL es más estable que rROL tanto inmovilizada como en solución. Se estudió la síntesis de un aromatizante utilizándose tres derivados inmovilizados: rROL-EP100, rROL-Eupergit®CM y rROL-Sepabeads. Se analizó el efecto de diversas variables sobre la velocidad inicial de reacción y conversión final. El derivado que mostró unos mejores resultados fue el obtenido a partir del EP100 aunque rROL-Sepabeads fue el derivado inmovilizado más estable. Mediante la metodología de la superficie de respuesta, pudo analizarse el efecto de la concentración de ácido butírico y la relación molar butírico:etanol sobre la velocidad inicial de síntesis, la conversión y la producción. Los resultados de velocidad inicial y conversión mostraron un claro efecto inhibidor e inactivación a elevadas concentraciones de butírico. De igual modo un exceso de etanol también resultaba inhibidor. Las condiciones óptimas se determinaron en base a un modelo para maximizar la producción de butirato de etilo. Finalmente, rROL mostró capacidad catalítica en otras reacciones de interés industrial como son, la síntesis de la cortexolona-21-acetato, lípidos estructurados de baja carga calórica además de triacilglicéridos sustitutivos de las grasas presentes en leches maternas.; Extracts of mature Rhizopus oryzae lipase overexpressed in Pichia pastoris (rROL) and commercial ones from the native microorganism (nROL) have been characterized. Specific activity of rROL extract was more than 40 fold higher than nROL. The presences of multiple bands of lipases around 34 kDa were both extracts. The influence of ionic strength on optimum temperature and pH was also determined from both extracts, significant differences were observed. Finally, the specificity against triacylglycerol esters and p-nitrophenols esters was also analyzed. Similar behaviour was obtained in front of triacylglycerol esters; however rROL shown an opposite behaviour compared to nROL in front of p-nitrophenol esters with preferences for long chain derivatives because of the presence of an esterase in the commercial product. Two different kinds of support, the polypropylene powder EP100 and Eupergit®C, were tested to immobilize the enzymes. The study of the stability of soluble and immobilized enzymes was performed by means of the Box-Hunter experiment design. The stability of a soluble extracts as well as immobilized derivatives was analyzed and the studies showed higher stability or nROL. In order to apply rROL a flavour synthesis, it was immobilized in three different kinds of support (EP100, Eupergit®CM and Octadecyl-Sepabeads) with the aim of using it in the production of ethyl butyrate. The effect of different parameters on initial reaction rate and yield has been studied for each biocatalyst. The results showed the EP100 derivative as the best choice in terms of initial rate and yield but Sepabeads derivative was the most stable. Moreover, by means of a response surface methodology, the effect of butyric acid concentration and molar ratio butyric acid:ethanol on yield, initial synthesis rate and production was studied. An inhibitory effect as well as inactivation of the enzyme was detected at high concentration of butyric acid. The ethanol also showed an inhibitory effect. The optimum conditions were selected in order to maximise the production. Finally, rROL was used to synthesize cortexolone-21-acetate as well as different kinds of structured lipids, obtaining good results

Systematic metabolic analysis of recombinant Pichia pastoris under different oxygen conditions A Metabolome and Fluxome Based Study

Wed, 19 Dec 2012 10:48:04 GMT

Systematic metabolic analysis of recombinant Pichia pastoris under different oxygen conditions A Metabolome and Fluxome Based Study Carnicer Heras, Marc L’anàlisi sistemàtic de la fisiologia cel·lular és de gran importància en la millora del coneixement sobre els microorganismes. En aquesta direcció, la biologia de sistemes ens permet l’anàlisi quantitatiu de diferents nivells fisiològics obtenint representacions in silico de les vies metabòliques estudiades que, en conjunt, s’adrecen a la millor comprensió del comportament de sistemes biològics complexos. Aquest projecte de recerca va ser dissenyat per contribuir en la comprensió de la fisiologia de Pichia pastoris sota diferents condicions d’estrès. Específicament, aquesta tesis se centre en l’estudi sistemàtic del conjunt de metabòlits lliures dins la cèl·lula i en la velocitat que aquests es transformen. En el Capítol 2, una caracterització dels principals component de la biomassa de P. pastoris es va realitzadar sota diferents condicions de. Per una altre part, la consistència dels fluxos dels metabòlits extracel·lulars van ser utilitzats per identificar la producció d’un subproducte de fermentació, arabinitol. En el Capítol 3, s’obtingué la relació entre diferents fluxos metabòlics del metabolisme central del carboni de P. pastoris mitjançant l’estudi del carboni marcat dels aminoàcids sintetitzats de novo. Posteriorment, aquest valors van ser utilitzats delimitant l’anàlisi de fluxos metabòlics sota diferents condicions d’oxigenació i producció de proteïna recombinant. Els resultat més destacats obtinguts foren la gran similitud entre els fluxos estimats per les soques productora i control en condicions equivalents. Tot i així, diferencies clares van ser observades quan es van comparar el patró de fluxos corresponents a diferents nivells d’oxigenació. L’anàlisi dels metabòlits lliures dins la cèl·lula va començar en el Capítol 4 amb l’avaluació sistemàtica de cinc protocols de parada ràpida del metabolisme en P. pastoris respecte la concentració de metanol i la temperatura. Com a resultat, la parada del metabolisme realitzada a -27ºC amb una solució de 60% v/v de metanol a ser amb la que menys pèrdues es van observar. Consecutivament, es va demostrar que cinc temps de residència són els necessaris per arribar a un estat estacionari del metabòlits intracel·lulars en cultius amb glucosa limitant. D’altra banda, sota les mateixes condicions de treball, els perfils intracel·lulars dels principals metabòlits eren similars entre els llevats P. pastoris i S. cerevisiae. En el Capítol 5, l’estequiometria redox i energètica de P. pastoris va ser validada veient un augment en els requeriments energètics d’aquesta sota condicions deficitàries d’oxigen. A més a més, es va realitzar un anàlisi termodinàmic dels metabòlits intracel·lulars mitjançant lo qual s’obtingueren millores en el patró de fluxos en la via de les pentoses fosfat conjuntament amb informació de l’estat redox del citosol. En el Capítol 6, la regulació transcripcional i termodinàmica dels fluxes del metabolisme central del carboni va ser investigada entre diferents condicions de cultiu. En general, la contribució dels diferents nivells omics en el canvi final dels fluxos metabòlics van resultar ser diferents entre els llevats P. pastoris i S. cerevisiae. Específicament, per P. pastoris, la regulació transcripcional va ser significant en la majoria de reaccions, contràriament al que s’havia descrit per S. cerevisiae. Finalment, en el Capítol 7, per una millor comprensió de l’efecte i la interacció de la disponibilitat d’oxigen i la producció d’una proteïna forania, es va realitzar un anàlisi quantitatiu del aminoàcids lliures intracel·lulars sota la producció d’aquesta proteïna i en diferents condicions d’oxigenació. Els valors obtinguts indicaren una variació significativa d’aquests aminoàcids intracel·lulars entre diferents disponibilitats d’oxigen. Sorprenentment, l’expressió d’aquesta es va veure que tenia un impacte limitat, però significant, en els pools d’aminoàcids. Amb tot, els canvis individuals observats no presentaven una correlació amb l’abundància relativa d’aquests en la proteïna recombinant, en canvi, concordava amb la variació de la composició aminoacídica de la biomassa.; The systematic analysis of the cell physiological it is critical to gain knowledge about microorganisms. Systems biology gives the opportunity to obtain quantitatively analysis of different physiological levels which allow the in silico representations of the studied pathways. Overall, this field is addressed to the crucial understanding of complex biological networks behaviour. This research project was aimed to contribute to the understandings of the Pichia pastoris physiology under different stress conditions. Specifically, the thesis was centred in the systematic analysis of the metabolome and fluxome omic levels. In Chapter 2, a consistent description of the biomass principal components of P. pastoris is obtained for different oxygenation conditions, as well as under recombinant protein producing and non-producing backgrounds obtaining the best estimation of the biomass composition. In addition, consistency of the input and output extracellular metabolic fluxes was used to identify the production of an unexpected by-product, which was subsequently identified as arabinitol. In Chapter 3, biosynthetically directed fractional 13C-labellings were performed obtaining information about the principals metabolic flux ratios of the carbon central metabolism of P. pastoris as well as a 13C-constrained metabolic flux analysis under the different cultures conditions. The most prominent feature obtained was the similarity in flux estimations between the expressing and the control strains. Nevertheless, clear differences were observed when comparing flux patterns corresponding to different oxygenations set points. The issue of metabolome analysis was started in Chapter 4 with the systematic evaluation of five quenching protocols applied to P. pastoris regarding the methanol concentration and temperature. As result, acceptable recoveries (>90%) were obtained for all quenching procedures tested. However, quenching at -27ºC in 60% v/v methanol performed slightly better in terms of leakage minimization. Thereafter, it was demonstrated that five residence times under glucose limitation were enough to reach stable intracellular metabolite pools. Moreover, when comparing P. pastoris and S. cerevisiae metabolomes, under the same cultivation conditions, similar metabolite fingerprints were found in both yeasts, except for the lower glycolysis. In Chapter 5, the redox and energy stoichiometry of P. pastoris was validated showing increasing energy requirements as the oxygen availability became shortage. In addition, a network-embedded thermodynamic analysis of the quantitative intracellular metabolites pools was performed allowing an improvement of the non-oxidative pentose phosphate pathway fluxes as well as determination of the oxygen impact over the redox state of the cytosol. In Chapter 6, the transcriptional and thermodynamic regulations over the metabolic flow between conditions were investigated for the central carbon metabolism reactions. Overall, the different omic contributions to the final metabolic flux changes were resulted to be different between P. pastoris and S. cerevisae. Specifically, for P. pastoris, transcriptional regulation was found to be in most cases significant, contrarily to the baker yeast. Finally, in Chapter 7, to better understand the effect and interplay of oxygen availability and foreign protein secretion on central metabolism, a first quantitative metabolomic analysis of free amino acids pools in a recombinant P. pastoris strain growing under different oxygen availability conditions was performed. The values obtained indicated significant variations in the intracellular amino acid levels due to different oxygen availability conditions. Notably, even that foreign protein productivities were relatively low, recombinant protein production was found to have a limited but significant impact. However, observed changes in individual amino acids pools were not correlated with their corresponding relative abundance in the recombinant protein sequence, but to the overall cell protein amino acid compositional variations.

Aracterització de l’operació i estudi metatranscriptòmic d’un bioreactor de dessulfuració d’alta càrrega d’H2S

Mon, 17 Dec 2012 10:37:36 GMT

Aracterització de l’operació i estudi metatranscriptòmic d’un bioreactor de dessulfuració d’alta càrrega d’H2S Rovira Camprubí, Roger Aquest apartat és un resum general del seguit de capítols que estructuren aquesta tesi doctoral. En aquest sentit es presenta una revisió bibliogràfica al voltant dels sistemes de tractament de gasos contaminants, centrant la introducció en el contaminant d’estudi, l’H2S, i els sistemes de tractament biològic. De manera similar, es presenta un apartat introductori al voltant dels bacteris sulfur‐oxidants. Complementant aquesta part, es fa un recull descriptiu de diferents tècniques de biologia molecular, basades en marcadors filogenètics moleculars, per a l’estudi de comunitats microbianes. Per últim, es presenta una revisió de les diferents tecnologies de seqüenciació de DNA de nova generació amb la intenció d’introduir i fonamentar l’aproximació bio‐òmica per a l’estudi de comunitats microbianes complexes. Seguidament en el segon capítol d’aquesta tesi, es desenvolupa un primer estudi al voltant de la posada en marxa i operació del biofiltre percolador de dessulfuració d’alta càrrega d’H2S, mitjançant la configuració d’un nou material de rebliment inorgànic desordenat. En base al monitoratge de diferents paràmetres, s’aconsegueix optimitzar el règim d’operació establint unes noves condicions d’operació que minimitzen la generació de sofre inorgànic en el bioreactor. En el tercer capítol, i com a aproximació inicial en l’estudi de les comunitats microbianes del bioreactor, es construeixen per a dos moments operacionals separats en el temps, dues llibreries gèniques de 16S rRNA. En base a la identificació d’espècies realitzada per seqüenciació dels fragments clonats, es seleccionen diverses espècies microbianes sulfur‐oxidants amb intenció d’estudiar la seva adaptació i dinàmica al llarg de l’operació. Mitjançant la tècnica FISH es visualitzen i quantifiquen aquestes espècies sulfur‐oxidants, realitzant un seguiment a diferents altures del cos del bioreactor permetent analitzar la dinàmica poblacional dels microorganismes hibridats. Complementant l’estudi realitzat per a la caracterització i el seguiment de poblacions microbianes, en el capítol quatre d’aquesta tesi es descriu el procés d’optimització de la metodologia necessària per a la realització de l’estudi metatranscriptòmic de les comunitats microbianes del biofitre. En aquest capítol es descriuen, per als diferents processos experimentals implementats, els resultats obtinguts amb l’objectiu d’optimitzar els rendiments d’extracció i purificació de mRNA. Finalment, assolits els rendiments necessaris tant en termes de quantitat com de qualitat, es presenta el protocol optimitzat per a la preparació de les mostres seqüenciades en la plataforma GS FLX de Roche&454. Finalment en l’estudi metatranscriptòmic presentat en el capítol cinc, es processen tres mostres corresponents a diferents zones del biofiltre. Inicialment s’apliquen diferents estratègies d’assemblatge de les lectures amb intenció d’optimitzar el càlcul d’assemblatge. Mitjançant l’anàlisi bioinformàtica es realitza la interpretació del metatranscriptoma referit a cada una de les zones de mostreig. Es quantifiquen els nivells d’expressió per a cada un dels contigs generats permetent l’anàlisi comparativa del grau d’expressió dels gens del biofiltre a diferents altures. ; This section is an overview of the different chapters that outline this thesis. In this sense it is presented a bibliographical review about the polluting gas treatment systems, focusing on the introduction of the contaminant study, H2S, and biological treatment systems. Similarly, there is an introductory section about sulfur‐oxidizing bacteria. Complementing this part includes a summary description of various molecular biology techniques based on molecular phylogenetic markers for the study of microbial communities. Finally, it is presented a review of new generation DNA sequencing technologies with the intention of introducing and establishing the bio‐omic approach for studying complex microbial communities. Then in the second chapter of this thesis, is developed a first study about biotrickling filter operation for desulfurization of high H2S loads by setting a new disordered inorganic packing material. Based on the monitoring of various parameters the system operation is optimized and established in new operating conditions that minimize the generation of inorganic sulfur in the bioreactor. In the third chapter, as initial approach to the study the microbial diversity in the bioreactor, two libraries of 16S rRNA genes are generated for two separate operational periods. Based on species identification performed by sequencing of cloned fragments, it has been selected several sulfur‐oxidizing species with the intention to study the community dynamics during the start up and bioreactor operation. Using the FISH technique, these sulfur‐oxidizing species have been identified and quantified, withdrawing biomass at different heights of the bioreactor to analyze the population dynamics of microorganisms hybridized. Complementing the study for the characterization and monitoring of microbial populations, the chapter four of this thesis describes the experimentation and optimization of the procedure to develop a metatranscriptomic work of microbial communities of the biofilter. This chapter describes the results obtained for different experimental procedures, with the aim of optimizing the yields of extraction and purification of mRNA. Finally achieved the required yields in terms of both quantity and quality, it is presented the optimized protocol for samples preparation to be sequenced in the GS FLX platform Roche & 454. In chapter five, are processed three metatranscriptomic samples from different areas of the biofilter. As initial procedure, different assembly strategies are experimented with the intention to optimize the assembly calculation of sequencing lectures. By bioinformatic analysis are performed the expression levels quantification for each contig generated, allowing comparative analysis of degree expression at different biofilter heights. In parallel, is performed a similarity search in different databases in search of specific functional annotation. With intention to extend the functional annotation of the resulting metatranscriptomes it is presented the characterization of contigs obtained by the analysis of gene ontology for each sequence. The enormous volume of sequence information generated is presented as a description of the global gene expression referring to different parts of the bioreactor desulfurization of high H2S load. Finally, the last chapter of the thesis presents a summary of the conclusions reached in this work, as well as a description of the possible continuation of this thesis study.

Modelització i estratègies de procés per a la producció de rhua en escherichia coli.

Wed, 12 Dec 2012 12:49:14 GMT

Modelització i estratègies de procés per a la producció de rhua en escherichia coli. Ruiz i Franco, Jordi Aquest treball es centra en l’estudi del procés de producció de la proteïna Ramnulosa 1-fosfat aldolasa (RhuA) en cultius d’alta densitat cel·lular d’Escherichia coli M15ΔglyA [pREP-4] pQEαβrham i la seva posterior purificació i immobilització a partir de tècniques de cromatografia d’afinitat a metalls. L’estudi de diferents estratègies de procés en bioreactor a escala laboratori heretades de treballs anteriors al grup de recerca on s’emmarca aquest treball permeten determinar una estreta dependència entre les condicions d’operació amb què es du a terme el procés i la qualitat (UA·mg-1RhuA) de la proteïna recombinant sintetitzada així com els rendiments de purificació de la proteïna sobre suports de tipus IMAC. És per aquest motiu doncs, que s’avaluen diferents estratègies de procés alternatives amb l’objectiu de maximitzar la qualitat de la proteïna recombinant sintetitzada i mantenir elevats nivells de purificació i immobilització d’aquesta per al seu ús com a biocatalitzador. Un primer pas per a l’optimització de la qualitat proteica consisteix a modelitzar matemàticament la producció de la proteïna recombinant en cultius d’alta densitat cel·lular en bioreactors a escala laboratori amb l’objectiu d’identificar l’efecte de les principals variables operacionals sobre aquesta. La modelització es realitza sobre una estratègia de procés base diferent de les heretades de treballs anteriors, que permet obtenir qualitats proteiques de partida superiors i identifica l’acumulació de glucosa, principal font de carboni, com a possible causa de degradació proteica ben entrada la fase d’inducció del cultiu a partir d’IPTG. Per altra banda, l’efecte de la inducció sobre el creixement cel·lular i sobre la pròpia producció de RhuA planteja la necessitat de redefinir les estratègies de cultiu implementades durant l’etapa d’inducció responent a perfils d’alimentació lineals (no incrementals) front els exponencials pre-programats tradicionals i a l’addició de determinats aminoàcids, prèviament a la inducció (i després d’un estudi de l’estructura primària de la proteïna), per tal de minimitzar les respostes d’estrès cel·lular a la sobreexpressió de proteïna. La combinació d’aquestes estratègies a escala laboratori porten a l’avaluació de la viabilitat del procés a una major escala productiva (30 L) amb resultats prometedors (màxims nivells d’activitat enzimàtica produïda i increments considerables de la quantitat de proteïna intracel·lular acumulada front d’estratègies de cultiu estàndard) que obren les portes a posteriors estudis per tal d’explotar la potencialitat del procés.; This work focuses on the study of the production process of the protein Rhamnulose 1-phosphate aldolase (RhuA) in high cell density cultures of Escherichia coli M15ΔglyA [PREP-4] pQEαβrham and its purification and immobilization through immobilized metal ion affinity chromatography techniques. The study of different process strategies in a laboratory scale bioreactor inherited from previous work allowed to determine a close dependency between the operating conditions that the culture is carried out through and protein quality ( AU·mg-1RhuA) as well as immobilization yields on IMAC supports. For this reason then, several alternative process strategies were tested in order to maximize the quality of the recombinant protein synthesized and maintain high yields of purification and immobilization to effectively use it as a biocatalyst. A first step for protein quality optimization was achieved by mathematical modeling the production of Rhamnulose 1-phosphate aldolase in high cell density cultures of E. coli in laboratory scale bioreactors in order to identify the effect of main operational variables on it. Cultures performed to calibrate the mathematical model were carried out through specific process strategies different than those inherited from earlier studies. These strategies allowed to obtain better values of protein quality and also to identify accumulation of glucose, the main carbon source, as a possible cause of protein degradation at the end of the induction stage of the process. Moreover, the effect of induction on cell growth and on RhuA production itself raised the need to redefine process strategies to be implemented during the induction stage of the process. Linear feeding profiles versus traditional predefined exponential feeding profiles and the addition of certain amino acids, before the induction stage (as a result of the study of the primary structure of the recombinant protein), were implemented to minimize the stress responses to overexpression of protein. The combination of these strategies, effective at laboratory scale, was used to scale-up the process to a 30 L fermenter to determine the feasibility of the process at a larger productive scale. Results obtained were promising from a production of RhuA point of view since maximum values for enzymatic activity were achieved and considerably increase of the amount of intracellular accumulated protein (comparing with induction schemes at the same intensity) was detected. The results open the door to further studies to be done in order to fully exploit the potential of the process

Aplicació de cèl·lules mare mesenquimals per a la regeneració de cartílag articular

Mon, 03 Dec 2012 16:06:50 GMT

Aplicació de cèl·lules mare mesenquimals per a la regeneració de cartílag articular Peris Puchol, David Les malalties articulars representen un problema de salut rellevant amb un prevalença molt alta (a Europa pot variar entre el 11% i el 25%) i que continua augmentant dia a dia en el món occidental. Durant els últims 20 anys, les cèl·lules mare mesenquimals adultes (CMMA) i les seves propietats regeneratives s’han estudiat intensament per trobar aplicacions factibles per a la cura d’aquestes malalties. La combinació d’aquestes cèl·lules amb materials sintètics, com els biopolímers, ha fet sorgir una nova branca mèdica, la medicina regenerativa. El treball que es presenta a continuació aborda el desenvolupament d’una teràpia basada en la medicina regenerativa pel tractament de lesions osteocondrals, on el cartílag articular afectat no es pot reparar ni regenerar per si sol. Es planteja el disseny i la realització d’un assaig preclínic per a la regeneració d’una lesió osteocondral artificial en model animal, oví en aquest cas, mitjançant una combinació de CMMA i un biopolímer. Com a punt de partida, es realitzen estudis de caracterització de les diferents fonts cel·lulars de CMMA provinents de tres teixits diferents: cartílag hialí, moll d’os i greix. S’han posat a punt els mètodes d’aïllament i expansió, i s’ha realitzat una caracterització de les cinètiques de creixement de les CMMA, obtenint resultats que indiquen una relació inversament proporcional entre la densitat de sembra i la velocitat específica màxima de creixement. Es demostra que les CMMA són mesenquimals amb l’anàlisi del fenotip, la fisiologia, la morfologia i la multipotencialitat que han mostrat al ser analitzades. Es dissenya un assaig preclínic per a la regeneració de lesions osteocondrals, en el model animal escollit, mitjançant un constructe format per CMMA i un polímer sintètic, l’Àcid poli-làctic-co-glicòlic (PLGA). La fabricació i la caracterització del constructe PLGA-CMMA es realitza en funció de l’assaig dissenyat. El PLGA s’estudia a nivell de porositat i de la seva capacitat per ser colonitzat homogèniament per les CMMA. Histològicament es demostra la colonització homogènia de les CMMA. Un cop caracteritzat el constructe es posa a punt un experiment pilot on s’aïllen CMMA de cartílag hialí extretes d’una ovella, s’expandeixen, es colonitzen en un cilindre de PLGA i es reintrodueixen artroscòpicament a l’articulació femorotibial, on prèviament s’ha generat una lesió osteocondral artificial, per avaluar la possible regeneració o reparació amb els resultats macroscòpics, imatges de ressonància magnètica i histologia de les mostres. Els resultats mostren un constructe biocompatible i bioreabsorbible que regenera cartílag hialí en alguns casos. Per confirmar aquests resultats es realitza un assaig preclínic de les mateixes característiques que el pilot, amb la comparació de les diferents fonts cel·lulars caracteritzades, amb un nombre superior d’animals i amb els temps d’estudi ampliats a 6 i 12 mesos . Els resultats mostren la seguretat del tractament desenvolupat i una eficàcia major en el tractament basat en l’aplicació de PLGA colonitzades amb CMMA provinents de moll d’os. Aquesta memòria s’estructura, doncs, de manera que inicialment es fa una introducció (capítol 1), on es realitza una descripció exhaustiva del cartílag hialí, els diferents tractaments de les patologies osteocondrals, el concepte de la medicina regenerativa, les CMMA, els biopolímers i les interaccions cèl·lula-polímer. Seguidament (capítol 2), es plantegen els principal objectius del treball. Al capítol 3 es realitza la caracterització cel·lular de les CMMA. A continuació ( capítol ) es realitzen els estudis previs amb el PLGA, les CMMA i la seva colonització, per a posar a punt el estudi pilot en model animal. Al capítol 5 es realitza l’assaig preclínic. En el capítol 6, s’exposen les principals conclusions extretes del treball. Finalment, es presenten els materials i mètodes emprats (capítol 7), i s’afegeix l’apèndix (capítol 8).; The joint diseases represent a significant health problem with a very high prevalence (in Europe varies between 11% and 25%) and still rising every day in the western world. Last 20 years, the adult mesenchymal stem cells and their regenerative properties have been studied intensively to find feasible applications for the cure of these diseases. The combination of these cells with synthetic materials such as biopolymers, has emerged a new branch of medicine, regenerative medicine. The work presented below focuses on the development of a therapy-based regenerative medicine for the regeneration of osteochondral injury where the cartilage is affected and cannot repair or regenerate itself. In this dissertation we present a design and realization of a preclinical trial for osteochondral injury regeneration, in sheep animal model, through a combination of CMMA and a biopolymer. As starting point, studies were performed to characterize different cellular sources of CMMA from three different tissues: hyaline cartilage, bone marrow and fat. Different methods have been set up for isolation and expansion of CMMA, and growth kinetics have been characterized, obtaining results that indicate an inverse relationship between seeding density and the maximum specific growth rate. We show that the CMMA are mesenchymal stem cell because of phenotype analysis, physiology, morphology and multipotentiality. A preclinical trial for regeneration of osteochondral lesions in animal model (sheep) is designed and composed by a construct consisting in CMMA colonized in a synthetic polymer, poly-Lactic Acid-co-glycolic (PLGA). The fabrication and characterization of PLGA-CMMA construct is performed based on the trial design. The PLGA is studied in terms of porosity and its ability to be homogeneously colonized by the CMMA. The homogeneous colonization of CMMA is demonstrated histologically. Once the construct is characterized, we set up a pilot experiment where hyaline cartilage was taken from a sheep and then CMMA were isolated, expanded, colonized in a cylinder of PLGA and reintroduced arthorscopically to the femorotibial joint, where previously we had generated an artificial osteochondral injury, to assess the regeneration or repair of articular cartilage. The regeneration evaluation was based on the macroscopic results, magnetic resonance imaging and histology samples. The results show the construct to be biocompatible, bioreabsorbible and hyaline cartilage regeneration in some cases. To confirm these results we performed a preclinical trial of the same features as the pilot, with comparison of different cell sources characterized before (bone marrow, hyaline cartilage and fat), with a larger number of animals and extended period study to 6 and 12 months. The results show safety and higher efficacy in the treatment based on the application of PLGA colonized with CMMA from bone marrow. This work is structured initially with an introduction (Chapter 1), which performs an exhaustive description of the hyaline cartilage, the different treatments of osteocondral pathologies, the concept of regenerative medicine, the CMMA, the biopolymers and cell-polymer interactions. Then (chapter 2), we set the main objectives of the work. In chapter 3 cellular characterization of CMMA is performed. Then (chapter 4) the preliminary studies with PLGA, the CMMA and colonization is performed in order to set up the pilot study in animal model. Chapter 5 performs preclinical trial. Chapter 6 summarizes the main conclusions of the work. Finally, there is the materials and methods (Chapter 7) used in this work, and Appendix (Chapter 8).

Eliminació biològica de nitrogen via nitrit d’un corrent amb alta càrrega d’amoni

Wed, 29 Aug 2012 13:09:04 GMT

Eliminació biològica de nitrogen via nitrit d’un corrent amb alta càrrega d’amoni Torà Suárez, Josep Anton En aquesta tesi s’ha estudiat l’eliminació biològica de nitrogen en aigües residuals amb alta càrrega d’amoni. Aplicant certes condicions d’operació en un sistema de llots actius es pot aconseguir la nitrificació parcial o nitritació, que és l’oxidació de l’amoni a nitrit, evitant la conseqüent oxidació d’aquest nitrit a nitrat. Aquesta reducció en el procés de nitrificació aporta un seguit d’avantatges en front de la nitrificació convencional, tals com la reducció de les necessitats d’oxigen en la nitrificació i de la matèria orgànica en la desnitrificació, l’increment de la velocitat de desnitrificació i la reducció de la producció de biomassa. Aquesta tesi s’ha presentat com a compendi de publicacions. A continuació es presenta un breu resum dels articles: En l’Article I es presenta un sistema de nitrificació parcial format per una planta pilot amb tres reactors de fangs actius en sèrie. Aquesta planta pilot es va inocular a partir de llots d’una EDAR urbana i es va operar amb un llaç de control de la càrrega de nitrogen aplicada que consisteix en la modificació del cabal d’entrada segons els valors d’OUR mesurat als reactors. Utilitzant aquest llaç de control i treballant amb un temps de residència cel·lular baix es va aconseguir rentar els bacteris nitrit-oxidants del sistema. Simultàniament, també es va aconseguir tractar una elevada càrrega d’amoni i es va demostrar la viabilitat del procés a llarg termini tot obtenint una nitrificació parcial amb pràcticament només nitrit. Posteriorment, en l’Article II, es presenta la desnitrificació del corrent de nitrit obtingut amb el sistema desenvolupat en l’Article I. Aquesta desnitrificació es va realitzar utilitzant diferents fonts de carboni tals com etanol, glicerol, lixiviats d’abocador i finalment llots primaris i secundaris fermentats. Aquest estudi es va dur a terme en reactors discontinus seqüencials (SBR) i es van obtenir bones velocitats de desnitrificació per totes les fonts de carboni estudiades excepte pels llots secundaris fermentats. En l’Article III, es presenta l’estudi de l’efecte d’una llarga aturada del sistema de nitrificació parcial tot deixant d’alimentar durant 30 dies. Aquest estudi es va realitzar en quatre reactors discontinus que es van operar en diferents condicions d’aeració. Durant aquest període de temps es va fer un seguiment de l’activitat dels bacteris amoni-oxidants mitjançant respirometries i l’anàlisi FISH. Es va observar que és millor aturar el sistema de nitrificació parcial en condicions anòxiques i, a poder ser, no més de dues setmanes. Finalment, es va obtenir una recuperació ràpida del sistema utilitzant el llaç de control per OUR emprat en la planta pilot de l’Article I. Finalment, en l’Article IV es presenta l’estudi de l’efecte de les inhibicions per amoníac i per àcid nitrós en els bacteris amoni-oxidants, a més de l’efecte d’aquestes inhibicions en condicions de limitació per carboni inorgànic. Es va comprovar que la inhibició per amoníac es pot descriure amb precisió amb al model cinètic Haldane i la inhibició per àcid nitrós a un model d’inhibició no competitiva. Es va observar que l’efecte d’aquestes inhibicions s’incrementa en condicions de limitació per carboni inorgànic, sent molt més gran en el cas de l’àcid nitrós.; En esta tesis se estudia la eliminación biológica de nitrógeno en aguas residuales con una alta carga de amonio. Aplicando ciertas condiciones de operación en un sistema de lodos activos se puede conseguir la nitrificación parcial o nitritación, que es la oxidación del amonio a nitrito, evitando la consecuente oxidación de este nitrito a nitrato. Esta reducción en el proceso de nitrificación aporta unas ventajas frente a la nitrificación convencional, tales como la reducción de les necesidades de oxigeno en la nitrificación y de la materia orgánica en la desnitrificación, el incremento de la velocidad de desnitrificación y la reducción de la producción de biomasa. Esta tesis se presenta como compendio de publicaciones. A continuación se presenta un breve resumen de los artículos: En el Artículo I se presenta un sistema de nitrificación parcial formado por una planta piloto con tres reactores de lodos activos en serie. Esta planta piloto se inoculó a partir de lodos de una EDAR urbana y se operó con un lazo de control de la carga de nitrógeno aplicada que consiste en la modificación del caudal de entrada según los valores de OUR medidos en los reactores. Utilizando este lazo de control y trabajando con un tiempo de residencia celular bajo se consiguió lavar las bacterias nitritooxidantes del sistema. Simultáneamente, también se consiguió tratar una elevada carga de amonio y se demostró la viabilidad del proceso a largo plazo obteniendo una nitrificación parcial con prácticamente solo nitrito. Posteriormente, en el Artículo II, se presenta la desnitrificación de la corriente de nitrito obtenida con el sistema desarrollado en el Artículo I. Esta desnitrificación se realizó utilizando distintas fuentes de carbono tales como etanol, glicerol, lixiviados de vertedero y finalmente lodos primarios y secundarios fermentados. En este estudio se utilizaron reactores discontinuos secuenciales (SBR) y se obtuvieron buenas velocidades de desnitrificación para todas las fuentes de carbono estudiadas excepto para los lodos secundarios fermentados. En el Artículo III, se presenta el estudio del efecto de una larga parada del sistema de nitrificación parcial dejando de alimentar durante 30 días. Este estudio se realizó en cuatro reactores discontinuos que se operaron en distintas condiciones de aireación. Durante este período de tiempo se hizo un seguimiento de la actividad de las bacterias amonio-oxidantes utilizando técnicas respirométricas y el análisis FISH. Se observó que es mejor parar el sistema de nitrificación parcial en condiciones anóxicas y, a poder ser, no más de dos semanas. Finalmente, se consiguió una recuperación rápida del sistema utilizando el lazo de control por OUR utilizado en la planta piloto del Artículo I. Finalmente, en el Artículo IV se presenta el estudio del efecto de las inhibiciones por amoníaco y por ácido nitroso en las bacterias amonio-oxidantes, además del efecto de estas inhibiciones en condiciones de limitación por carbono inorgánico. Se comprobó que la inhibición por amoníaco se puede ajustar con precisión utilizando el modelo cinético Haldane y la inhibición por ácido nitroso utilizando el modelo de inhibición no competitiva. Se observó que el efecto de estas inhibiciones se incrementa en condiciones de limitación por carbono inorgánico, siendo mucho mayor en el caso del ácido nitroso.; Biological nitrogen removal of high-strength ammonium wastewater was studied in this thesis. Applying specific operational conditions in an activated sludge system, partial nitrification or nitritation (oxidation of ammonium to nitrite) was achieved, avoiding the consequently oxidation of this nitrite to nitrate. This reduction in the nitrification process provides some advantages in comparison to the complete nitrification process, such as the reduction of the oxygen requirements during nitrification and the organic matter during denitrification, the increasing of the denitrification rates and the reduction of the biomass production. This thesis was presented as a compendium of publications and a brief summary of the papers are presented: In Paper I, a partial nitrification system consisting of a pilot plant with three continuous stirred tank reactors in series is presented. This pilot plant was inoculated with sludge from a municipal WWTP and it was operated with a control loop of the nitrogen loading rate which was applied modifying the inflow rate depending on the OUR values measured in the reactors. With this control loop and low sludge retention time the washout of the nitrite-oxidizing bacteria was performed. Simultaneously, almost a complete partial nitrification to nitrite with a high nitrogen loading rate was achieved during a long term operation. Subsequently, in Paper II, the heterotrophic denitrification of the nitrite obtained with the pilot plant developed in Paper I was presented. Different organic carbon sources such as ethanol, glycerol, landfill leachate, fermented primary sludge centrate and fermented secondary sludge centrate were used in the heterotrophic denitrification. This study was carried out in sequential batch reactors (SBR) and a complete denitritation of a high-strength nitrite wastewater was achieved using these organic carbon sources with the exception of fermented secondary sludge centrate. In Paper III the study of the effect of a long-term starvation of a partial nitrification system during 30 days was presented. Four ammonium-starved reactors under different conditions of aeration were used. During this period the ammonia-oxidizing bacteria activity was evaluated using respirometric tests and the FISH analysis. It was observed that is better to shut-down a partial nitrification system under anoxic conditions and, if it is possible, no more than two weeks. Finally, a fast recovery of the system was achieved using the OUR control loop used in the pilot plant of Paper I. Finally, in Paper IV a study of the inhibitory effect by free ammonia and free nitrous acid on the ammonia-oxidizing bacteria under total inorganic carbon limitations and without total inorganic carbon limitations was presented. It was observed that the inhibition by free ammonia can be described accurately using the Haldane model and the inhibition by free nitrous acid using a non-competitive inhibition model. The effect of these inhibitions increased under total inorganic carbon limitation, being much higher in the case of the free nitrous acid.

Millora de soques i estudi d’estratègies de procés per a la producció de Fuculosa-1-fosfat aldolasa recombinant activa en Escherichia coli

Wed, 29 Aug 2012 12:53:38 GMT

Millora de soques i estudi d’estratègies de procés per a la producció de Fuculosa-1-fosfat aldolasa recombinant activa en Escherichia coli Sans i Duran, Cristina Aquest treball de tesi doctoral s’engloba dins la coneguda Biotecnologia Blanca, concretament en el camp de la Producció de Proteïnes Recombinants. Les aplicacions d’aquesta àrea de coneixement en processos industrials es basa en el disseny de microorganismes per obtenir productes d’alt valor afegit. En aquest cas, el microorganisme productor és Escherichia coli i la proteïna d’interès es tracta de Fuculosa-1-fosfat aldolasa, enzim que catalitza estereoselectivament reaccions d’addició aldòlica. Per una banda, s’han dut a terme diverses modificacions a nivell de plasmidi per tecnologia de DNA recombinant a fi de millorar un sistema d’expressió auxotròfic per la glicina. Aquestes millores no tan sols han anat enfocades a l’increment dels nivells de producció de la proteïna d’interès, sinó també a la obtenció d’un sistema d’expressió segur, simplificat i estable. El creixement i producció de la Fuculosa-1-fosfat aldolasa mitjançant les soques modificades han estat efectuats en matrassos d’Erlenmeyer i en fermentadors operant en discontinu alimentat quan s’ha requerit. Per altra banda, l’expressió de la proteïna d’interès en forma de cossos d’inclusió, a banda de soluble, ha permès obtenir alts nivells de Fuculosa-1-fosfat pura i activa. L’aplicació d’aquests cossos d’inclusió prèviament immobilitzats per encapsulament mitjançant la tecnologia Lentikat® en una reacció estereoselectiva d’addició aldòlica ha donat com a resultat un biocatalitzador actiu, robust i estable a llarg termini. Per tant, es tracta d’una petita aportació en la biotecnologia industrial que intenta conceptualitzar el bioprocés de manera hol·lística tot fusionant diverses àrees de coneixement. Tot i que no s’ha realitzat una avaluació econòmica del procés, consideracions tals com la possibilitat de reutilització del biocatalitzador han estat contemplades, per tal que el resultat fos atractiu industrialment parlant.

Retrofitting Analysis for Improving Benefits of A/O WWTPs Considering Process Control Aspects

Wed, 29 Aug 2012 09:27:01 GMT

Retrofitting Analysis for Improving Benefits of A/O WWTPs Considering Process Control Aspects Cunha Machado, Vinicius En aquest treball s'ha desenvolupat una metodologia per implementar l'eliminació biològica de fòsfor (EPBR) en les plantes de tractament d'aigües residuals urbanes (EDAR) amb configuració anòxica / òxica (A/O) dissenyades per eliminar únicament matèria orgànica (DQO) i nitrogen (N). L'objectiu és eliminar biològicament i simultàniament DQO, N i fòsfor (P) tenint en compte aspectes de control de processos i amb el millor rendiment d'operació. La metodologia proposada cerca exhaustivament un model del procés, utilitzant les dades existents de la planta per determinar els paràmetres cinètics. El model de la planta s'ha calibrat utilitzant una metodologia basada en la matriu d'informació de Fisher (FIM). Usant l'estructura del model de la planta i les noves configuracions de plantes que es proposen, s'utilitza un conjunt de criteris per identificar quina és la millor alternativa. Entre els criteris utilitzats es troben: qualitat de l'efluent, solidesa de l'estructura de control del procés, costos d'operació i costos d'inversió per a compra d'equips i per dur a terme canvis en la distribució de la planta. També s'estudia la viabilitat dels organismes acumuladors de fòsfor (PAO) i l'efecte del creixement d'aquestes espècies amb diferents estructures de control del procés.; En este trabajo se ha desarrollado una metodología para implementar la eliminación biológica de fósforo (EPBR) en las plantas de tratamiento de aguas residuales urbanas (EDAR) con configuración anóxica / óxica (A/O) diseñadas para eliminar únicamente materia orgánica (DQO) y nitrógeno (N). El objetivo es eliminar biológica y simultáneamente DQO, N y fósforo (P) teniendo en cuenta aspectos de control de procesos y con el mejor rendimiento de operación. La metodología propuesta busca exhaustivamente un modelo del proceso, utilizando los datos existentes de la planta para determinar los parámetros cinéticos. El modelo de la planta se ha calibrado utilizando una metodología basada en la matriz de información de Fisher (FIM). Usando la estructura del modelo de la planta y las nuevas configuraciones de plantas que se proponen, se utiliza un conjunto de criterios para identificar cuál es la mejor alternativa. Entre los criterios utilizados se encuentran: calidad del efluente, solidez de la estructura de control del proceso, costos de operación y costos de inversión para compra de equipos y para llevar a cabo cambios en la distribución de la planta. También se estudia la viabilidad de los organismos acumuladores de fósforo (PAO) y el efecto del crecimiento de estas especies con diferentes estructuras de control del proceso.; A methodology for retrofitting existent Anoxic/Oxic (A/O) wastewater treatment plants (WWTP) to perform the Enhanced Biological Phosphorus Removal (EPBR) in order to biologically remove organic matter (COD), nitrogen (N) and phosphorus (P) at the same time, considering process control aspects, was developed. The proposed methodology exhaustively searches a process model, using existent plant data to determine the current kinetic parameters. The plant model is calibrated using a methodology based on the Fisher Information Matrix. Using the plant model structure, new plant configurations are proposed and a set of criteria are used to identify what is the best alternative. Amongst the criteria are: the robustness of the process control structure, operating costs, investment costs to perform changes in the plant layout and equipments and the effluent quality. The feasibility of phosphorus accumulating organisms (PAO) growth and the effect of these species in the existent process control structure are also studied.

Evaluation of Trametes versicolor ability to bioremediate Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs) in different matrices

Wed, 29 Aug 2012 08:18:48 GMT

Evaluation of Trametes versicolor ability to bioremediate Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs) in different matrices Borràs Camps, Eduard Com a resultat de les activitats humanes, la contaminació deguda a productes químics alliberats al medi s’ha convertit en un problema global, essent una amenaça real per a l’activitat humana. La contaminació pot afectar qualsevol compartiment de l’ecosistema. Els hidrocarburs derivats del petroli, on s’inclouen els hidrocarburs policíclics aromàtics (HAPs), són contaminants que afecten de manera particular el sòl. Actualment existeixen diverses tècniques per a la restauració d’emplaçaments contaminats, inclosa la bioremediació. La micorremediació, àrea de coneixement en què s’emmarca la tesi, ha guanyat atenció en els últims anys ja que és una tècnica ambientalment respectuosa. Aquest treball presenta els resultats de les investigacions prèvies al desenvolupament d’un tractament de bioremediació de sols contaminats per hidrocarburs policíclics aromàtics mitjançant el fong ligninolític Trametes versicolor. Els resultats de l’esmentada investigació es presenten en tres apartats diferenciats. El primer es centra en la producció de biomassa del fong per a posteriors aplicacions en processos de bioremediació. Es divideix en dues seccions: • La primera es basa en la producció de biomassa en cultiu submergit. Els experiments es van centrar en formular un medi definit de cultiu de baix cost que permetés obtenir nivells elevats de biomassa, en la morfologia desitjada (pellets). El reactor fluïditzat per polsos d’aire amb control de pH va resultar ser el més adequat. La producció s’escalà a un bioreactor de 10 litres. • La segona secció analitza la colonització del fong sobre suports lignocel·lulòsics provinents de residus agrícoles per a posterior aplicació en el sòl. La selecció dels millors substrats per a la colonització es va basar en el nivell de biomassa (ergosterol), la producció de lacasa i la capacitat de degradar naproxè en 24 hores. Es va demostrar que el fong era capaç de colonitzar el sòl tant en condicions estèrils com en no estèrils mantenint, en tot cas, la capacitat degradativa. El segon apartat es centra en la degradació d’hidrocarburs policíclics aromàtics pel fong. Es divideix en tres seccions: • La primera es basa en la selecció d’un surfactant per a la degradació de HAPs en medi líquid, essent el millor el surfactant no iònic Tween 80. Es va poder demostrar la capacitat degradativa de diversos HAPs en medi líquid; tant en experiment per separat com en mescles. Així mateix, també es va demostrar que en les condicions de cultiu l’enzim lacasa podia degradar alguns dels compostos. • La segona secció fa referència a la identificació de productes intermediàris de degradació d’HAPs. També es va estudiar la capacitat de degradació d’aquests intermediaris per part del fong. • En la tercera secció es van provar diferents sistemes de degradació en sòl, on el bioslurry es presenta com el més efectiu en termes d’eficàcia de degradació. Es va poder comprovar que en les biopiles airejades el fong va tenir problemes derivats del rang termofílic assolit. El darrer apartat es basa en la degradació dels HAPs de la creosota. Es divideix en dues seccions: • La primera es centra en la degradació dels HAPs de la fracció aromàtica de la creosota. Es van estudiar diferents sistemes i es va determinar que el fong era més eficient en degradació en biopiles. En cultius submergits, medi líquid i slurry, el fong era efectiu en la degradació d’HAPs de baix pes molecular però no en aquells d’alt pes molecular. Es va observar l’efecte inhibitori sobre Trametes tant dels compostos addicionals afegits junt amb la creosota com en augmentar la concentració de HAPs. ! • La segona secció és fruit de la col·laboració amb el Laboratori de Biotecnologia Ambiental de l’Institut de Microbiologia de l’Acadèmia de les Ciències de la República Txeca de Praga. S’estudià l’efecte de la interacció del fong amb la població microbiana del sòl durant processos de bioremediació d’HAPs en sòl.! El treball experimental s’ha dut a terme en el “Grup de degradació de contaminants industrials i valorització de residus” del Departament d’Enginyeria Química de la UAB. L’objectiu general de recerca del grup és el desenvolupament de processos biotecnològics per a degradar compostos xenobiòtics difícilment degradables per tractaments convencionals.; Como consecuencia de las actividades humanas, la contaminación debida a productos químicos liberados en el medio se ha convertido en un problema global, siendo una amenaza real para la actividad y la salud de los seres vivos. La contaminación puede afectar a cualquier compartimento del ecosistema. Concretamente, los hidrocarburos derivados del petróleo son contaminantes que afectan de manera particular al suelo, entre los cuales destacan los hidrocarburos policíclicos aromáticos (HPAs). Actualmente existen diversas técnicas para la restauración de emplazamientos contaminados por estos compuestos. Cabe destacar que en los últimos años la comunidad científica ha centrado especialmente los esfuerzos en el campo de la micorremediación (área de conocimiento donde se enmarca la presente tesis) dado que se trata de una técnica ambientalmente respetuosa. El trabajo presenta los resultados de las investigaciones previas al desarrollo de un tratamiento de bioremediación de suelos contaminados por hidrocarburos policíclicos aromáticos mediante el hongo ligninolítico Trametes versicolor. Los resultados de la mencionada investigación se presentan en tres apartados diferenciados. El primero se centra en la producción de biomasa del hongo para posteriores aplicaciones en procesos de bioremediación. Se divide en dos secciones: • La primera se basa en la producción de biomasa en cultivo sumergido. Los experimentos se centraron en formular un medio de cultivo definido de bajo coste que permitiera obtener niveles elevados de biomasa, en la morfología deseada (pellets). El reactor fluidizado por pulsos de aire con control de pH resultó ser el más adecuado. La producción se escaló a un bioreactor de 10 litros. • La segunda sección analiza la colonización del hongo sobre soportes lignocelulósicos provenientes de residuos agrícolas para posterior aplicación en el suelo. La selección de los mejores sustratos para la colonización se basó en el nivel de biomasa (ergosterol), la producción de lacasa y la capacidad de degradar naproxeno en 24 horas. Se demostró que el hongo era capaz de colonizar el suelo tanto en condiciones estériles como no estériles manteniendo, en todo caso, la capacidad degradativa. El segundo apartado se centra en la degradación de hidrocarburos policíclicos aromáticos por el hongo. Se divide en tres secciones: • La primera se basa en la selección de un surfactante para la degradación de HPAs en medio líquido, siendo el surfactante no iónico Tween 80 aquel que dio mejores resultados. Se pudo demostrar la capacidad degradativa de diversos HPAs en medio líquido; tanto en experimentos por separado como en mezclas. Asimismo, también se demostró que en las condiciones de cultivo la enzima lacasa podía degradar algunos de los compuestos. • La segunda sección hace referencia a la identificación de productos intermediarios de degradación de HPAs. También se estudió la capacidad de degradación de estos intermediarios por parte del hongo. • En la tercera sección se probaron diferentes sistemas de degradación en suelos, donde el bioslurry resultó el más efectivo en términos de eficacia de degradación. Se pudo comprobar que en las biopilas aireadas el hongo tuvo problemas derivados del rango termofílico alcanzado. El último apartado se basa en la degradación de los HPAs de la creosota. Se divide en dos secciones: • La primera se centra en la degradación de los HPAs de la fracción aromática de la creosota. Se estudiaron diferentes sistemas y se determinó que el hongo era más eficiente en degradación en las biopilas. En cultivos sumergidos, medio líquido y slurry, el hongo era efectivo en la degradación de HPAs de bajo peso molecular pero no en aquellos de alto peso molecular. Se observó el efecto inhibitorio sobre Trametes versicolor tanto de los compuestos adicionales añadidos junto con la creosota como al aumentar la concentración de HPAs. • La segunda sección es fruto de la colaboración con el Laboratorio de Biotecnología Ambiental del Instituto de Microbiología de la Academia de las Ciencias de la República Checa en Praga. Se estudió el efecto de la interacción del hongo con la población microbiana del suelo durante procesos de bioremediación de HPAs en suelos. El trabajo experimental se ha llevado a cabo en el "Grupo de degradación de contaminantes industriales y valorización de residuos" del Departamento de Ingeniería Química de la UAB. El objetivo general de investigación del grupo es el desarrollo de procesos biotecnológicos para degradar compuestos xenobióticos difícilmente degradables mediante tratamientos convencionales.; As a result of human activities pollution aroused as a global concern due to improper release of chemicals into the environment. Contamination represents a real threat to humans and can affect any ecosystem compartment. Petroleum hydrocarbons affect typically soil, including polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs). Several conventional clean-up techniques are available for site restoration, including bioremediation. Mycoremediation, attained interest in the last decades as it is assumed to be an environmental-friendly technique. This work shows the results of the basic research previous to the development of a polycyclic aromatic hydrocarbons polluted soil bioremediation treatment by means of the white rot fungus Trametes versicolor. The results of the mentioned research are presented in three differentiated sections. The first section focuses on the fungal biomass production for posterior applications in bioremediation processes. It is divided into two subsections: • The first part focuses on biomass production of in submerged cultures. The experiments were aimed at formulating a low-cost defined medium to obtain high amounts of biomass, in the preferred morphology (pellets). The air-pulsed fluidized bioreactors equipped with pH control were the most appropriate. The production was scaled-up to a 10 liters bioreactor. • The second part analyzes the fungal colonization of lignocellulosic supports for further application in soil. The selection of the optimal substrate for colonization based on active biomass amounts, laccase production and the capacity to degrade naproxene in 24 hours. It was demonstrated that the fungus was capable of colonizing soil both under sterile and non-sterile conditions maintaining, in any case, the degradative capacity. The second section focuses on the fungal ability to degrade polycyclic aromatic hydrocarbons. It is ddivided into three subsections: • The first part focuses on the selection of an optimal surfactant for PAHs degradation in liquid medium, obtaining the best results with the non-ionic surfactant Tween 80. The degradation of several PAHs by T. versicolor in liquid medium was demonstrated; both in individual-PAHs experiment as well as in PAHs-mixtures. Likewise, it was also demonstrated that under culture conditions laccase might degrade some of the studied compounds. • The second section includes the identification of PAHs metabolites arising from degradation. The fungal degradation capacity of these intermediates was also examined. • In the third section different degradation systems of were tested for soil treatment, the bioslurry resulted as the most effective in terms of degradation efficiency. It was checked out that in aerated biopiles, the fungus had problems derived from attaining termophilic ranges. The last section deals with the creosote-PAHs degradation. It is divided into two subsections: • The first part focuses on the fungal PAHs-degradation of the creosote aromatic fraction. Different systems were studied and it was determined that the fungus was more efficient at degrading PAHs in biopiles approach. In submerged cultures, liquid medium and slurry, the fungus was effective at degrading low-molecular-weight PAHs but not those of high-molecularweight. It was also observed inhibitory effects on Trametes due to the additional compounds present in creosote as well as when increasing the total PAHs concentration. • The second section is a result of the collaboration with the Laboratory of Environmental Biotechnology in the Institute of Microbiology, which belongs to the Academy of Sciences of the Czech Republic (Prague). The effect on PAHs removal during the interaction between soil microbial population and white-rot fungi during soil bioremediation processes was studied. The experiments have been carried out in the "Group of degradation of industrial pollutants and valuation of waste" from the Department of Chemical Engineering in the UAB. The main research motivation of the group is to develop specific biotechnological processes to degrade xenobiotic compounds that are scarcely degraded by conventional treatments.

Biodegradació de compostos orgànics halogenats amb Trametes versicolor

Thu, 17 Nov 2011 12:01:59 GMT

Biodegradació de compostos orgànics halogenats amb Trametes versicolor Vilaplana Artigas, Marcel Actualment, un dels grans reptes de la bioremeiació és disposar de microorganismes que siguin capaços de degradar, en diferents hàbitats, una gran diversitat d’estructures químiques complexes. En el cas dels tractaments amb fongs de podridura blanca, aquests han demostrat la seva capacitat de degradar, tant en sòl com en medi líquid, una gran varietat de compostos recalcitrants. El treball de Tesi que es presenta engloba diferents aspectes de l’estudi de la degradació de diferents contaminants orgànics halogenats mitjançant el fong de podridura blanca Trametes versicolor. Els resultats corresponents es presenten en quatre apartats diferenciats: El primer apartat tracta el disseny i posterior aplicació d’un reactor per degradar tricloroetilè (TCE) en fase aquosa mitjançant el fong. En la primer lloc es determinen els diferents paràmetres necessaris per al disseny del bioreactor, que corresponen a l’equilibri gas-líquid i sòlid-líquid del contaminant i el consum d’oxigen del fong. A continuació, es presenta el disseny del reactor, incloent la determinació de l’equació cinètica de degradació de TCE. En tercer i últim lloc, es mostra l’aplicació del procés de disseny en un reactor hermètic agitat mecànicament per comprovar la seva validesa i l’estudi de l’efecte de diferents paràmetres en la degradació de TCE. El segon apartat correspon a la degradació de polibromodifenil éters (PBDEs) en medi líquid mitjançant el fong. S’ha estudiat la capacitat del fong per degradar les mescles de decabromodifenil éter (decaBDE), octabromodinfenil éters (octaBDEs) i pentabromodifenil éters (pentaBDEs). En tots els casos el fong és capaç d’eliminar els compostos presents a les diferents mescles amb un elevat percentatge. La prova d’inhibició enzimàtica realitzada indica que el citocrom P450 és l’enzim responsable del primer pas de degradació d’aquests contaminant mitjançant el fong. En el cas de les mescles d’octaBDEs i pentaBDEs, s’ha detectat la formació d’un hexabromodifenil éter monohidroxilat i d’un tetrabromodifenil éter monohidroxilat, respectivament, per a un temps de 12 hores. Aquests dos compostos són degradats posteriorment pel fong. En el cas del decaBDE, no s’ha detectat la formació de cap PBDE hidroxilat, però s’ha de tenir en compte que no s’ha disposat de mostres de degradació per a temps inferiors a 24 h. El tercer apartat correspon a l’estudi de la degradació de contaminants mitjançant el procés de biooxidació avançada amb el fong, que es basa en l’oxidació de contaminants mitjançant radicals hidroxils induïts pel fong. Primer, es mostra l’optimització de la degradació de TCE en ampolles de sèrum mitjançant aquest procés, a partir de l’estudi de l’efecte de la velocitat d’agitació, de la relació de volum entre la fase gas i la fase líquida i de la concentració de biomassa en el procés de degradació. Els percentatges de degradació de TCE obtinguts en un reactor hermètic agitat mecànicament han estat significativament inferiors als obtinguts en ampolles de sèrum. En segon i últim lloc, es presenta l’aplicació en reactor d’aquest procés per degradar la carbamazepina. S’ha treballat amb un reactor fluïditzat per polsos d’aire en mode discontinu seqüencial i en continu. En els dos casos, el procés és capaç de degradar la carbamazepina durant un temps llarg, obtenint majors percentatges de degradació operant en mode discontinu seqüencial. El quart i últim apartat es centra en l’aplicació de l’anàlisi isotòpic d’elements estables en la degradació de contaminants mitjançant el fong. Entre tots els contaminants estudiats, només en el cas del TCE i el tetracloroetilè s’ha obtingut un percentatge de degradació suficientment elevat per a poder aplicar la tècnica esmentada amb fiabilitat. Per aquests dos compostos, el fraccionament de carboni obtingut a causa del procés de degradació no es pot considerar significatiu.; Nowadays, one of the most challenges for bioremediation is to have microorganisms that are able to degrader, in different environments, a large diversity of complex chemical structures. In the case of treatments by white-rot fungi, they are able to degrade, both in soil and water, a large variety of recalcitrant compounds. The PhD work that is presented includes different aspects about the study of some halogenated organic compounds by the white-rot fungi Trametes versicolor. The results obtained are presented in four different sections: The first section describes the reactor design and application to degrade trichloroethylene (TCE) in liquid medium by the fungus. First of all, the determination of several important parameters related to reactor design, which correspond to TCE gas-liquid and solid-liquid equilibriums and fungus oxygen consume, is shown. After that, the reactor design is presented, including the TCE degradation equation. At last, it is showed the design process application in a mechanical agitated and hermetical reactor to check its validity and to study the effect of different parameters in TCE degradation. The second section corresponds to polibromodiphenyl ethers (PBDEs) degradation in liquid medium by the fungus. The fungus capacity to degrade decabromodiphenyl ether (decaBDE), octabromodiphenyl ethers (octaBDEs) and pentabromodiphenyl ethers (pentaBDEs) mixtures has been studied. In all cases, the fungus is able to eliminate all the compounds included in these mixtures in a high percentage. The enzymatic inhibition test performed indicates that the cytochrome P450 is the enzyme involved in the first step of decaBDE degradation. In relation to octaBDEs and pentaBDEs mixtures, a hydroxilated hexabromodiphenyl ether and a hydroxilated tetrabromodiphenyl ether have been detected, respectively, at a time of 12 hours. These two compounds are later degraded by the fungus. In the case of decaBDE, it has not been detected any hydroxilated PBDE as a degradation product, but it is important to indicate that it has not been possible to analyze samples for an experimental time earlier than 24 hours. The third section corresponds to study of pollutants degradation by the fungus under quinone redox cycling conditions, which consists of compounds oxidation by hydroxyl radicals induced by the fungus. Firstly, the TCE degradation optimisation in serum bottles is shown. This optimisation is based on the study of agitation speed, gas-liquid volume relation and biomass concentration effects on pollutant degradation. TCE degradation percentages obtained in a mechanical agitated and hermetical reactor have been significantly lower than the results obtained in serum bottles. After that, the mechanism application in a reactor in order to degrade carbamazepine is presented. The experiments have been carried out in an air pulses bioreactor in sequenced batch mode and continuous mode. In both cases, the degradation process is able to degrade the pollutant for a long time period, obtaining higher degradation percentages if sequenced batch reactor is performed. The last section is focused on compound-specific stable isotope analysis application in pollutant degradation by the fungus. Among all the pollutants degraded, only TCE and tetrachloroethylene degradation percentages have been high enough to obtain a reliable application of this technique. In both cases, the carbon fractionation obtained due to degradation process is not significant.

Disseny i desenvolupament de minibioreactors amb instrumentació per a l’optimització de cultius cel· lulars

Thu, 03 Nov 2011 09:52:05 GMT

Disseny i desenvolupament de minibioreactors amb instrumentació per a l’optimització de cultius cel· lulars Soley Astals, Albert L’activitat de recerca i desenvolupament en el camp de la biotecnologia genera de forma altament dinàmica noves cèl· lules i productes d’interès en múltiples sectors. En aquest context, cal explorar en temps raonables i amb mitjans altament tecnificats i estandarditzats, el potencial productor de les diferents cèl· lules modificades, en quant al seu creixement, la capacitat producció i la qualitat dels productes obtinguts. Establir les condicions d’un procés productiu basat en cèl· lules requereix completar un nombre d’etapes molt elevat: des de la selecció del model cel· lular i la realització de treballs de biologia molecular fins a assolir un procés productiu amb unes condicions optimitzades. En aquest treball es presenta el disseny i desenvolupament d’un sistema de múltiples minibioreactors orientats a escometre les primeres fases del desenvolupament del bioprocés de forma ràpida, sistemàtica i amb informació rellevant sobre l’evolució de les principals variables de cultiu, de manera que sigui possible realitzar, entre altres experiments, la selecció de clons, caracterització del seu comportament en cultiu, optimització de medis de cultiu, i proves de toxicitat de molècules sobre els perfils dels cultius. El disseny del sistema de múltiples minibioreactors presentat reuneix els avantatges dels sistemes habituals de cultiu a petita escala, com són el treball amb volums reduïts i la capacitat de realitzar diversos cultius en paral· lel, així com els avantatges del treball amb reactors de major volum, com són l’homogeneïtat i el coneixement que les principals variables del cultiu estan en valors no limitants per a aquest. Així doncs, s’ha donat una elevada importància a que els minibioreactors disposin d’un sistema d’agitació que permeti assegurar l’homogeneïtat del seu contingut, i a disposar de sistemes de seguiment. Aquests permeten d’una banda conèixer els valors de les variables dels cultius, i d’altra banda la caracterització del comportament de les cèl· lules estudiades, obtenint dades útils per al disseny dels bioprocessos corresponents que puguin ser transferires amb èxit els processos cap a majors escales, i permetent prosseguir el camí cap a l’escala de producció sense que apareguin incidències, bàsicament pèrdues de productivitat, degudes a la manca de coneixement existent habitualment en les cultius a petita escala. Prèviament a iniciar l’etapa de desenvolupament tecnològic, s’ha realitzat un estudi preliminar per tal de tenir un major coneixement de les prestacions necessàries dels equips, tant pel que fa a la funcionalitat dels sistemes que proporcionen les condicions necessàries per al creixement dels cultius (agitació i aeració), com pel que fa a la potencialitat i limitacions dels sistemes de seguiment seleccionats. D’entrada, l’objectiu ha estat seguir el pH i l’oxigen dissolt com a variables del cultiu, la concentració cel· lular per a conèixer el creixement, i el consum d’oxigen com a indicador metabòlic, si bé el pH també és una variable que dóna informació interessant relativa al metabolisme i fisiologia dels cultius. Donats els diferents enfocaments de desenvolupament possibles en funció dels models cel· lulars a emprar, se n’ha seleccionat un d’ells, les cèl· lules animals. Així, el disseny detallat del sistema de minibioreactors s’ha orientat cap a aplicacions amb aquest model cel· lular, i aquesta elecció també s’ha tingut en compte en el capítol de desenvolupament, on s’han posat a punt els sistemes per a permetre la realització d’aquest tipus de cultius (bàsicament agitació i aeració), realitzant una caracterització hidrodinàmica dels minibioreactors desenvolupats. D’altra banda, també en aquest capítol es presenta el desenvolupament de les tècniques per a seguir la concentració cel· lular, el pH, l’oxigen dissolt i consum d’oxigen. La darrera part d’aquest treball, una vegada desenvolupades i validades les diferents tecnologies, consta de la realització de cultius emprant diferents tipus de cèl· lules, valorant la reproduïbilitat de l’equip i discutint la informació que aquest proporciona quan una línia cel· lular es cultiva a condicions diferents. Finalment, també cal remarcar que aquest treball obre les portes al desenvolupament de noves prestacions per al sistema de múltiples minibioreactors desenvolupat, com són el control del pH i de l’oxigen dissolt, i la possible utilització del sistema per al cultiu de bacteris i llevats.; The research and development in the biotechnological field generates a vast amount of new cells and products of interest for various economical sectors. In this framework, it is needed to explore, in reasonable times and with automated means, the potential of the generated, regarding its growth, productivity and quality of the obtained products. Establishing the culture conditions of a productive process based in cells required accomplishing several stages: from the selection of the cellular system and the realization of molecular biology works to the achievement of a bioprocess having optimized conditions. In this work the design and development of a multiple minibioreactor system is presented, having the aim of fastening the first stages of the bioprocess development, in a systematic way, and acquiring relevant information regarding the evolution of the main culture variables, making possible the realization of various sorts of experiments such as clone selections, the characterization of its culture performance, the culture medium optimization, and the toxicological evaluation of molecules. The design of the multiple minibioreactor system combines the benefits of the usual small scale culture systems, such as the consumption of small amounts of medium ad the capability of performing multiple parallel cultures, and the benefits of larger scale culture systems, such as the homogeneity and the knowledge of the main culture variables, ensuring these do not have limiting values. Consequently, special attention has been paid to the development of a stirring system ensuring the homogeneity of the bioreactor content and to the monitoring systems allowing the characterization of the cell growth and metabolism, which permits having sufficient data to upscale the process, minimizing the risks of such duty. Before starting the technological development stage, a preliminary study has been done with the aim of identifying and characterizing the required equipment features, regarding the auxiliary equipment supplying the culture conditions (stirring, aeration), and also regarding the potentiality and limitations of the monitoring systems. The main culture environmental variables to be monitored are pH and dissolved oxygen, whereas to monitor growth cellular concentration is to be followed. Additionally, oxygen consumption is to be used as a metabolic indicator, and pH is also a variable from which it can be obtained interesting information regarding culture physiology and metabolism. Given the different design possibilities for the required technologies depending on the cellular models to be used, one of them, precisely mammalian cells have been chosen. Thus, the detailed design and development of the minibioreactor system has been directed towards applications with such cellular model, paying special attention to the characteristic requirements of mammalian cells (basically agitation and aeration), and to the hydrodynamic characteristics of the system. On the other hand, also in the technological development chapter, techniques to monitor cell concentration, pH, dissolved oxygen and oxygen consumption have been implemented. Once the technological development has been completed and the required functionalities validated, in the last part of this work various cultures are performed with the aim of evaluating the culture reproducibility, and the information obtained by the equipment as it is used for culturing a certain cell line at various conditions. Finally, it is also interesting to underline the potential fields of development based on this work: new features of the multiple minibioreactor system, such as the pH and dissolved oxygen controls, and the potential use of the system for the culture of bacteria and yeast.

Different indices to express biodegradability in organic solid wastes. Application to full scale waste treatment plants

Thu, 03 Nov 2011 09:20:29 GMT

Different indices to express biodegradability in organic solid wastes. Application to full scale waste treatment plants Ponsá Salas, Sergio Els residus biodegradables reben una atenció especial en el marc legislatiu europeu actual (Revised Framework Directive 2008/98/CE) i en la seva transposició a Espanya a traves del Plan Nacional Integrado de Residuos 20082015 (PNIR), degut al significatiu impacte ambiental derivat quan aquestos residus no són tractats correctament i al seu potencial ús com recursos renovables mitjançant l’obtenció de compost i biogàs. Pel correcte tractament d’aquestos residus és imprescindible el desenvolupament d’instal·lacions i plantes de tractament eficaces i eficients. La correcta avaluació de l’efectivitat i eficiència d’aquestes instal·lacions requereix una mesura fidedigna del contingut de matèria orgànica biodegradable dels residus i per tant de la seva estabilitat. Aquesta mesura permetria: i) establir una classificació dels residus i productes en base a la seva biodegradabilitat i estabilitat; ii) la correcta avaluació de les plantes de tractament en funcionament; iii)el disseny de noves i optimitzades instal·lacions, i iv) la determinació del potencial impacte ambiental dels productes finals. La informació obtinguda mitjançant l’anàlisi de paràmetres purament físics o químics dels residus no es capaç de reflectir la naturalesa biològica dels residus. És molt extensa la bibliografia que descriu, proposa i avalua l’ús d’índexs biològics, aerobis i anaerobis, per caracteritzar els residus orgànics. De la mateixa manera, aquestos índexs, han estat proposats en diferents normatives de paises europeus com paràmetres d’estabilitat. En aquesta Tesis s’han desenvolupat noves metodologies per a la determinació d’índexs biològics aerobis i anaerobis, optimitzant les metodologies ja referenciades, eliminant les seves limitacions i ampliant la seva utilitat: índexs respiromètrics aerobis, expressats com velocitat de consum d’oxigen i consum acumulat durant un temps determinat i índexs anaerobis, expressats com producció acumulada de biogàs i metà durant un temps determinat o total. Aquestes metodologies s’han avaluat i verificat mitjançant les següents aplicacions: 1) Optimització del procés de compostatge de fangs procedents d’EDARs urbanes, determinant la relació d’estructurant‐fang mínima necessària per obtenir un producte final higienitzat i estabilitzat a escala industrial. 2) Completa avaluació d’una planta de tractament mecànic‐biològic (MBT) amb capacitat per tractar 240.000 tones/any de residus municipals, monitoratge del procés i determinació de les eficàcies d’eliminació de matèria orgànica en cada etapa. 3) Estudi específic del pretractament mecànic d’una MBT i la seva influencia en l’eliminació de matèria orgànica biodegradable. 4) Determinació de potencials totals de producció de biogàs mitjançant l’anàlisi d’índexs biològics anaerobis de curta durada. 5) Determinació de les correlacions entre indexs aerobis i anaerobis. Determinació de les correlacions entre els diferents indexs aerobis i discusió sobre la diferent informació que poden proporcionar. 6) Caracterització completa de residus basant‐se en la diferent informació proporcionada pels indexs respiromètrics aerobis. 7) Redacció d’un protocol estandarditzat per a la determinació de la biodegradabilitat de residus orgànics de diferent origen i tipologia per l’Agencia de Residus de Catalunya, basant‐se en la determinació d’índexs biològics aerobis. Els resultats obtinguts en tots aquestos treballs i estudis confirmen la idoneïtat de l’ús dels índexs biològics com mesura real del contingut de matèria orgànica biodegradable dels residus i per tant de la seva estabilitat. A més es poden considerar com un paràmetre clau pel disseny i control de plantes de tractament de residus.; Los residuos biodegradables reciben una atención especial en el marco legislativo europeo actual (Revised Framework Directive 2008/98/CE) y en su transposición en España a través del Plan Nacional Integrado de Residuos 20082015 (PNIR), debido al significativo impacto ambiental derivado cuando no son tratados correctamente y a su potencial uso como recursos renovables mediante la obtención de compost y biogás. Para ello, es imprescindible el desarrollo de instalaciones y plantas de tratamiento eficaces y eficientes. La correcta evaluación de la efectividad y eficiencia de estas instalaciones requiere una medida fidedigna del contenido de materia orgánica biodegradable de los residuos y por consiguiente de su estabilidad. Esta medida permitiría: i) establecer una clasificación de residuos y productos en base a su biodegradabilidad y a su estabilidad; ii) la correcta evaluación de las plantas en funcionamiento; iii) el diseño de nuevas y optimizadas instalaciones; y iv) la determinación del potencial de impacto ambiental de los productos finales. La información obtenida mediante el análisis de parámetros puramente físicos o químicos de los residuos no es capaz de reflejar la naturaleza biológica de los residuos. Es muy amplia la bibliografía que describe, propone y evalúa el uso de índices biológicos, aerobios y anaerobios, para caracterizar los residuos orgánicos. Asimismo, éstos índices han sido propuestos en diferentes normativas de países europeos. En esta Tesis se han desarrollado nuevas metodologías para la determinación de índices biológicos aerobios y anaerobios, optimizando las metodologías ya referenciadas, eliminando sus limitaciones y ampliando su utilidad: índices respirómetricos aerobios, expresados como velocidad de consumo de oxígeno y su consumo acumulado durante un tiempo determinado e índices anaerobios expresados como producción acumulada de biogás y metano durante un tiempo determinado o total. Estas metodologías se han evaluado y verificado mediante las siguientes aplicaciones: 1) Optimización del proceso de compostaje de lodos procedentes de EDARs urbanas, determinando la relación de estructurante‐lodo mínima necesaria para obtener un producto final higienizado y estabilizado a escala industrial. 2) Completa evaluación de una planta de tratamiento mecánico‐biológico (MBT) con capacidad para tratar 240.000 toneladas/año de residuos municipales, monitorización del proceso y determinación de las eficacias de eliminación de materia orgánica en cada etapa. 3) Estudio específico del pretratamiento mecánico de una MBT y su influencia en la eliminación de materia orgánica biodegradable. 4) Determinación de potenciales totales de producción de biogás mediante el análisis de índices biológicos anaerobios de corta duración. 5) Determinación de correlaciones entre índices aerobios y anaerobios. Determinación de correlaciones entre diferentes índices aerobios y discusión sobre la diferente información que proporcionan. 6) Caracterización completa de residuos basándose en la diferente información proporcionada por los índices respirométricos aerobios. 7) Redacción de un protocolo estandarizado para la determinación de la biodegradabilidad de residuos orgánicos de diferente origen y tipología para la Agència de Residus de Catalunya basándose en la determinación de índices biológicos aerobios. Los resultados obtenidos en todos estos trabajos confirman la idoneidad del uso de índices biológicos como medida real del contenido de materia orgánica biodegradable de los residuos y por lo tanto de su estabilidad. Además pueden considerarse como un parámetro clave para el diseño y control en plantas de tratamiento de residuos.; Biodegradable waste receives especial attention in the European Legislation (Revised Framework Directive 2008/98/CE) and this has been also reflected in Spanish Legislation in the Plan Nacional Integrado de Residuos 20082015 (PNIR), due to the high importance that this municipal solid waste fraction has on the waste treatment environmental impact when it is not treated correctly and the possibility of recycling the biodegradable waste, to finally obtain compost or/and biogas that means green energy. For this purpose is necessary to develop suitable facilities for all waste treatments and assure the correct and efficient operation of such treatment and management facilities or plants. The correct determination of process efficiency in these facilities requires a reliable measure of the biodegradable organic matter content of the wastes and their stability. This measure would allow: i) to establish a waste classification based on the biodegradability and stability; ii) the correct evaluation of plant and facilities performance; iii) the design of new and optimum facilities and waste treatments; and iv) to determinate the environmental impact of the final products of these facilities. The information given by the analysis carried out just considering physical and chemical parameters is not able to reflect the correct biological nature of the wastes. It is really considerable the bibliographic references regarding the description, use and evaluation of biological indices, both aerobic and anaerobic, to characterize organic wastes. Additionally, these indices have already been proposed in some European countries’ Legislations. In this Thesis, new methodologies have been developed to determine aerobic and anaerobic biological indices, trying to optimize the already published methodologies by detecting their weaknesses, proposing improvements and increasing their utility. The indices obtained using these methodologies are: aerobic respirometric indices, expressed as the oxygen consumption rate and cumulative oxygen consumption during a given time and anaerobic indices, expressed as cumulative biogas and methane production during a given time or total biogas or methane production. These methodologies have been assessed, evaluated and verified in different facilities, different treatments and in several works with different aims: 1) Optimization of the composting process of dewatered wastewater sludge, determining the minimum ratio of pruning waste used as bulking agent to obtain a hygienized and stabilized product in full scale facilities. 2) Complete assessment of a mechanical‐biological treatment (MBT) plant treating 240.000 tones each year of municipal solid wastes. Process monitoring an determination of process efficiency regarding organic matter biodegradation. 3) Specific study of the mechanical pretreatment in a MBT plant and how it affects to the biodegradable organic matter removal. 4) Determination of the biogas production potential using anaerobic biological indices, measured in a short experimental time. 5) To obtain correlations between aerobic and anaerobic indices. Additionally, to correlate aerobic indices among them and analyzing the different information that they provide. 6) Using the information provided by aerobic respiration indices to completely characterized organic wastes. 7) Establishment of a standardized protocol to determine the biodegradability of organic wastes, from different origin and nature using aerobic biological indices to Agència de Residus de Catalunya. The results obtained in all works and studies confirm the suitability of biological indices to be measure the biodegradable organic matter content and stability of solid wastes. Additionally, these indices can be considered as key parameters to design and control waste treatment facilities and processes.

Estudi de configuracions de bioreactors i materials de rebliment per al tractament de mescles complexes de compostos orgànics i inorgànics volàtils

Tue, 18 Oct 2011 07:45:12 GMT

Estudi de configuracions de bioreactors i materials de rebliment per al tractament de mescles complexes de compostos orgànics i inorgànics volàtils Hernández Sicilia, Jerónimo En el desenvolupament d’aquesta tesi s’ha intentat donar solució a diverses necessitats observades en equips i instal·lacions a nivell industrial. En aquest sentit, cal destacar el fet d’haver estat en contacte directe amb la realitat industrial, ja que ha permès tenir un concepte més acurat de les necessitats del camp de la biofiltració a escala real. Aquesta visió és la que manca en alguns casos i provoca la pèrdua de perspectiva en l’aplicabilitat real de diversos estudis doctorals. Aquestes necessitats van derivar en diversos estudis, on es van avaluar diferents materials de rebliment clàssics i novedosos en diferents configuracions de bioreactors pel tractament de mescles complexes. Amb aquest objectiu es realitzen les següents aportacions científiques: Caracterització físico química dels materials de rebliment utilitzats al llarg de la tesi. Desenvolupament d’una metodologia per a la fabricació d’un nou material híbrid format per argil·la pirol·litzada recoberta d’una fina capa de compost per a la seva utilització en biofiltres convencionals. Avaluació de la influència d’utilitzar un cultiu específic com a inòcul en la biodegradació d’NH3 i una barreja de compostos orgànics volàtils, COVs (hexanal, àcid butíric, DMS (dimetil sulfur), DMDS (dimetil disulfur), MIBK (metil isobutil cetona) i α-pinè), empleant el material híbrid inoculat amb el cultiu específic front al material híbrid inoculat amb llots d’una estació depuradora d’aigües residuals. Estudiar la viabilitat de la fusta de pi i d’àlber en biofiltres percoladors tractant una mescla complexa, composta per etilmercaptà (EM), àcid butíric, NH3 i H2S, durant un període d’operació de gairebé 100 dies en termes d’eficàcia, estabilitat i pèrdua de càrrega. Du a terme l’estudi d’efectes creuats entre H2S, NH3 i l’EM en dos biofiltres percoladors reblits amb fusta d’àlber i escuma de poliuretà, mitjançant l’increment de la concentració de N-espècies (NH4+, NO2- i NO3-) i S-espècies (SO42- i S2-) a la fase líquida dels biofiltres percoladors. Du a terme estudis poblacionals mitjançant la tècnica de FISH (fluorescence hybridization in situ). Es va fer un seguiment de l’evolució temporal i longitudinal d’espècies sulfuro oxidants i nitrificants al biofiltre reblit amb escuma de poliuretà. Part d’aquest estudi científic es troba publicat en un article a una revista científica internacional i s’està en fase d’elaboració de tres més. D’altra banda, els resultats obtinguts en aquesta tesi s’han presentat en tres congressos internacionals. No es va perseguir un únic objectiu en el desenvolupament d’aquesta tesi. S’ha intentat donar solució a les diverses necessitats observades a nivell industrial. En aquest sentit, cal destacar el fet d’haver estat en contacte directe amb la realitat ja que ha permès tenir una concepte més acurat de les necessitats reals al camp de la biofiltració a nivell industrial. De fet, part dels resultats obtinguts s’estan utilitzant a nivell industrial amb èxit. A més, el coneixement adquirit ha permès l’aplicació de les estratègies d’operació desenvolupades dins d’aquesta tesis en altres estudis relacionats dins del mateix grup d’investigació.; In the development of this thesis the main objective was to give an answer to several requirements observed at industrial facilities. In this sense, it is necessary to highlight the direct contact between our research group and the industrial facilities in cooperation, which allowed having a more accurate concept of the main needs in the field of the biofiltration at real scale. This vision is usually missing at laboratory studies and can cause a big distance between the real necessities and as a result the real applicability of several thesis. These requirements ended up in several studies, where different novel and classic packing materials have been evaluated under different configurations of bioreactor for the treatment of complex mixtures. With this purpose as the main aim the following scientific contributions were achieved: Physico chemical characterization of the packing materials employed along the thesis. Development of a methodology for the manufacture of a new hybrid material constituted by a spherical argyle pellets covered with a fine layer of compost for its use in conventional biofilters. Evaluate the influence of using several enriched cultures as inocula on the treatment of a complex mixture with the new hybrid packing material versus a classical packing material such as pine bark. The pollutants were NH3 and a mixture of six volatile organic compounds, COVs (hexanal, α-pinene, DMS (dimethyl sulphide), DMDS (dimethyl disulphide), MIBK (methyl isobutyl ketone) and butyric acid). These compounds were selected as they regularly appear in emissions of municipal solid waste treatment facilities. Study the feasibility of pine and poplar wood in biotrickling filters treating a complex mixture, composed by ethylmercaptan (EM), butyric acid, NH3 and H2S, during a period of operation of almost 100 days in terms of removal efficiency, stability and pressure drop. Carry out a crossed effect study between NH3, H2S and EM in two biotrickling filters packed with poplar wood and polyurethane foam, by means of the increase of the concentration of N-species (NH4+, NO2- and NO3-) and S-species (SO42- and S2-) in the liquid phase of the biotrickling filters. Study the evolution of the bacterial community of a lab-scale biotrickling filter packed with polyurethane foam treating a complex mixture (NH3, H2S and EM) by means of FISH technique (fluorescence in situ hybridization). This study was applied in order to describe microbial composition and dynamics along the bioreactor. Part of this work has been published in an international scientific journal and three more publications are under preparation. Furthermore, the results obtained in this thesis have presented in three international conferences. On the other hand, as a result of being in direct contact with the industrial requirements, part of these results obtained has been successfully applied at real scale. Moreover, the knowledge achieved in this thesis has allowed the application of several operational strategies in other related studies in the same research group.

Estratègies d’operació per a la producció de lipases de Rhizopus oryzae amb el fenotip Mut(s) de Pichia pastoris mitjançant substrats mixtes

Mon, 17 Oct 2011 13:21:09 GMT

Estratègies d’operació per a la producció de lipases de Rhizopus oryzae amb el fenotip Mut(s) de Pichia pastoris mitjançant substrats mixtes Arnau Jiménez, Carol En aquest treball s’ha optimitzat el procés de producció de lipases de Rhizopus oryzae amb el fenotip Muts de Pichia pastoris mitjançant la utilització de substrats mixtes establint les condicions de procés més favorables. S’utilitza un sistema de 48 milibioreactors de 12 ml de volum amb l’objectiu d’optimitzar el procés de selecció de l’estratègia de cultiu més efectiva. Quan els cultius es realitzen utilitzant els fenotips Muts i Mut+ de P. pastoris sota promotors induïbles (AOX i FLD) s’obté un creixement deficient. La principal problemàtica recau en el sistema de condensació que presenten els milibioreactors a la part superior. S’utilitza el promotor GAP utilitzant glicerol i glucosa com a substrats, amb el que es demostra la viabilitat del sistema de 48 milibioreactors pel seguiment de bioprocessos. Posteriorment davant les avantatges que presenta la utilització de substrats mixtes en soques de fenotip Muts sota el promotor AOX, s’utilitzen sorbitol o glicerol juntament amb el metanol per observar l’efecte del cosubstrat sobre la producció de ROL. A l’utilitzar el sorbitol es realitzen cultius en semicontinu mantenint la concentració de metanol fixada en 0.5, 2 i 4 g l-1 i es manté la μ fixada en 0.01 i 0.02 h-1. S’observa que la concentració de metanol residual en el medi de cultiu és el paràmetre clau per l’optimització de la producció de ROL, trobant-se els valors màxims quan aquesta es troba fixada a 2 g l-1. A l’augmentar o bé disminuir aquesta concentració, la productivitat disminueix considerablement (2 vegades). Finalment es valida un sistema SIA per a l’anàlisi de sorbitol en línia. El sorbitol es considera un cosubstrat excel·lent però presenta una baixa μmax, fent així que el procés de producció sigui menys efectiu, si es compara amb una font de carboni alternativa. S’utilitza el glicerol com a cosubstrat, el que permetrà treballar a μ 5 vegades superiors. Es realitzen cultius en semicontinu mantenint la concentració de metanol fixada en 2 g l-1 (valor optimitzat prèviament). En aquest treball es realitzen diferents cultius on la μ es manté fixada en 0.1, 0.05 i 0.02 h-1. Es conclou que per evitar la repressió del promotor AOX la relació establerta entre les μ ha de ser inferior a 6 (μGli μMet-1), degut que al superar aquest valor s’observa una clara repressió del promotor AOX. A continuació, es decideix realitzar el canvi d’escala de les condicions més productives. Es realitzen varis cultius utilitzant el reactor a un volum inicial de treball de 30 l. Després d’estimar un favorable canvi d’escala es reprodueixen les condicions obtingudes en el millor dels processos. Durant aquest primer cultiu s’obtenen valors de productivitat volumètrica i específica 2.8 vegades inferiors als obtinguts prèviament en 5 l. Es realitzen experiments per comprovar la mescla del metanol al reactor UD50 mostrant un gradient màxim de 0.5 gMet l-1 a les diferents alçades. Es realitza una modificació al sistema d’addició del metanol, addicionant-lo de forma submergida a mitja alçada del reactor. Posteriorment els resultats milloren en un 48%, en comparació a l’addició pel capçal del reactor. Finalment es treballa amb una construcció genètica del fenotip Muts de P. pastoris que inclou la coexpressió del gen HAC1. Es treballa amb 2 soques, la primera coexpressa el gen HAC1 de forma induïble sota el promotor AOX i la segona ho realitza de forma constitutiva sota el promotor GAP. Quan s’utilitza la soca que coexpressa el gen de forma induïble, es troben millores significatives (augment de 1.5 vegades de la productivitat) al realitzar una estratègia amb substrats mixtes (sorbitol i metanol) a les condicions prèviament optimitzades. Quan s’utilitza la soca que coexpressa el gen de forma constitutiva, no es presenten millores en el procés de producció.; The objective of this thesis was to optimize the production of Rhizopus oryzae lipase in fed-batch mixed substrate conditions with a Pichia pastoris Muts strain. A milibioreactors bloc of 48 reactors with 12 ml working volume was tested to optimize the culture conditions under fed-batch strategy. When Mut+ and Muts phenotypes were used under AOX and FLD promoters, no satisfactory growth was observed, related with a deficiency presented by the cooler system allowing a lose of methanol of 0.5 gMet l-1 h-1. However, when Pichia pastoris under the constitutive promoter GAP was used, satisfactory growth was observed obtaining similar values than the ones obtained at higher volumes (5 l). In conclusion the 48 milibioreactors bloc represents an excellent tool to optimize the ROL production under GAP promoter, although was not satisfactory under AOX and FLD promoters. Subsequently to the advantage of using mixed substrates in place of using methanol as a sole carbon source, some experiments were done to optimize the ROL production under fed-batch conditions using sorbitol and glycerol as cosubstrats. When sorbitol was used the specific growth rate was maintained on 0.01 i 0.02 h-1 by a preprogrammed exponential feed. Methanol set-point concentration was maintained on 0.5, 2 i 4 g l-1 controlled by a predictive algorithm. Lipolytic activity, yields, productivity and specific productivity, but also specific growth, consumption and production rates were analyzed showing that the best values were reached when methanol concentration was fixed on 2 g l-1 showing an important reduction when this set-point was increased or decreased, independently of the specific growth rate used. The experiments showed that the key parameter was the set-point of methanol. On the other hand the specific growth influence was not representative. Finally a SIA analyser of sorbitol was tested. Sorbitol is considered an excellent cosubstrat but this low μmax in comparison with other possible cosubstrats, assures low productions. Different experiments using glycerol as cosubstrat were made at a constant methanol set-point of 2 g l-1, at three different glycerol feeding rates to assure a constant specific growth rate of 0.02, 0.05 and 0.1 h-1, by means of a pre-programmed exponential feeding rate strategy. The best production values were reached at the lowest specific growth rate tested. With Muts phenotype glycerol could not increase the productivity of the process comparing with sorbitol due to inhibitory effect on methanol consumption and recombinant lipase production. The specific growth relation must be fixed lower than 6 (μGli μMet -1), to avoid AOX promoter repression. The scale-up of the most effective process was done using a Biostat UD50 (30 l working volume). Methanol concentration was fixed on 0.02 h-1 and the specific growth rate was fixed on 0.02 h-1 by a sorbitol pre-programmed exponential feed. An encouraging scale-up was assumed (better KLa and similar geometry), although the first feed-batch cultivations under this conditions did not reproduced the values obtained under lab scale (5 l). Problems were related to the unsuccessful distribution (maximal gradient was 0.5 gMet l-1) of the substrates along the different height of the reactor. Methanol addition was submerged to the half height of the reactor to improve substrate distribution along the reactor. Feed-batch cultivation was done, and ROL production values were increase about 48%, in comparison with result obtained when methanol was added by the reactor headspace. And important increase was obtained, but is still necessary further research to reproduce values obtained in lab-scale. Finally a new Pichia pastoris strain construction co-expressing constitutively and inductively HAC 1 gene was used to optimize ROL production. Feed- batch cultivations were done using methanol and sorbitol as cosubstrats under the same conditions previously optimize (methanol concentration on 2 g l-1 and μ on 0.02 h-1). When inductively co-expression was used important improvements were obtained on productivity and specific productivity. On the other hand, when constitutively coexpression was used, inferior production values were obtained in comparison with results obtained with the non engineered strain.

Bioremediation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs)-contaminated soil: process evaluation through composting and anaerobic digestion approach

Wed, 13 Jul 2011 11:27:50 GMT

Bioremediation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs)-contaminated soil: process evaluation through composting and anaerobic digestion approach Sayara, Tahseen A. S. Among the different available remediation technologies, it is well-known that bioremediation methods which mainly depend on microorganisms to degrade, transform, detoxify or break down the contaminants, they are recognized as cost-effective and environmental-friendly methods. In fact, microorganisms “engine of bioremediation process” carry out their normal duty under aerobic or anaerobic conditions, which without doubt extends and motivates the desires to make use of such abilities to reduce environmental threats caused by various contaminants. However, to achieve satisfactory results during any bioremediation process, providing optimal conditions for microorganisms is considered as an essential/crucial task. Composting as one of the applied bioremediation technologies used to remediate soils contaminated with organic contaminants like PAHs still needs more investigation although a valuable effort has been devoted to elucidate the behaviour of this process in the remediation of PAHs-contaminated soils. However, till recently, anaerobically treatment of PAHs-contaminated soil received less attention as it was believed that PAHs are poorly or even impossible to be degraded under such conditions. Therefore, the present study tried to touch both aerobically bioremediation of PAH-contaminated soil through composting and anaerobically treatment of the same soil under strict methanogenic conditions. For both remediation approaches, the effect of some controlling factors had been also evaluated through experiment design methodology employing central design (CCD) technique. Regarding the composting process, the obtained results demonstrated that this technology is an advantageous and indisputable method to decontaminate PAHs-contaminated soils within short period. Additionally, compost derived from the organic fraction of municipal solid wastes (OFMSW) was found to enhance the contaminants (PAHs) removal rate to high extent. Moreover, a lucid correlation between the contaminants removal rate and the compost stability degree was observed, such that more stable composts better enhanced the remediation process as these composts are believed to have a considerable fraction of humic matter which facilitates the desorption of the contaminants, and get more available as a consequence. At the same time, treatments with stable composts do not produce high temperature during the composting process, and normally they are in the mesophilic ranges which are more favourable for such bioremediation process. Bioaugmentation of the process through introducing white-rot fungi with desired catalytic capacity (Trametes Versicolor) in attempt to accelerate the degradation process demonstrated that no effect or enhancement was achieved through such approach. In the second part of the research, anaerobically treatment of PAHs-contaminated soil has been investigated under strict methanogenic conditions employing two types of inocula; thermophilic and mesophilic. The obtained results demonstrated the effectiveness of such biological treatments in this field. Nevertheless, the process was relatively less effective compared with composting. Furthermore, under these conditions and due to unclear reasons, reversible results were obtained as PAHs concentrations were increased with prolonged incubation, indicating the reversed bioformation of PAHs under such oxygen-deficient conditions. Therefore, future work should be devoted to clarify the reasons behind this behaviour.

Desenvolupament i anàlisi d'un bioprocés per a l'obtenció de vectors adenovirals per a teràpia gènica

Tue, 12 Apr 2011 14:47:19 GMT

Desenvolupament i anàlisi d'un bioprocés per a l'obtenció de vectors adenovirals per a teràpia gènica Gálvez Sánchez, Jordi En les últimes dues dècades, la teràpia gènica ha permès plantejar noves aproximacions en l'àmbit de la medicina personalitzada. Es troba orientada a guarir malalties actualment incurables i/o a millorar ostensiblement la qualitat de vida dels pacients, gràcies a la introducció de material genètic al nucli de la cèl·lula diana per permetre, augmentar o suprimir l'expressió d'un gen específic amb finalitat terapèutica. El vector és l'agent que juga el paper cabdal en aquest mecanisme. D'entre els possibles tipus (virals i no virals), destaca el vector adenoviral per la seva preeminència en els actuals assajos preclínics amb humans i per la necessitat de proveir demandes de mercat importants.
El present treball aborda el desenvolupament complet d'un bioprocés per a l'obtenció de vectors adenovirals per a teràpia gènica: estudia els diferents aspectes que conformen el bioprocés, i analitza la implementació a escala industrial de la millor alternativa possible.
Com a punt de partida, es realitzen estudis previs per conèixer la interacció dels vectors adenovirals amb les línies cel·lulars productores existents. S'aprofundeix en les tècniques de cultiu de dos candidats cel·lulars concrets: HEK293 (adherent) i HEK293S (no adherent). A partir de la infecció d'ambdós amb el vector adenoviral, es caracteritzen els principals paràmetres del cicle infectiu, els quals permeten concloure que la línia cel·lular HEK293S resulta més apropiada en base a una major productivitat.
Aquestes dades proporcionen la base per desenvolupar l'etapa de producció del bioprocés. Aquesta s'estructura entorn als tres factors fonamentals que descriuen la bioreacció (el monitoratge, l'estratègia i el sistema de producció), els quals s'analitzen en profunditat. Es demostra la validesa del mètode de la velocitat de consum d'oxigen (OUR) per realitzar el monitoratge en línia de l'activitat cel·lular durant les fases de creixement i d'infecció. Posteriorment, es decideix avaluar dues estratègies de producció: l'estratègia en discontinu (estratègia de referència) i l'estratègia en continu amb perfusió (estratègia que proporciona les condicions el més semblants possibles a les que tindria la cèl·lula in vivo). Finalment, s'apliquen els anteriors factors en l'anàlisi del sistema de producció, en concret, amb la utilització de dues alternatives: l'anomenat sistema convencional (bioreactor de tanc agitat Biostat Bplus) i el sistema no convencional (bioreactor basat en tecnologia d'un sol ús Wave Bioreactor). A partir dels resultats obtinguts, es pot constatar que l'estratègia de producció en continu amb perfusió proporciona elevades concentracions cel·lulars, incrementant-se també tant la productivitat com la concentració vírica final. D'altra banda, també es posen de manifest els avantatges operacionals del sistema de cultiu no convencional, encara que sacrificant la possibilitat d'utilitzar la mesura de la velocitat de consum d'oxigen (OUR).
Per tal de completar el treball, es desenvolupa l'etapa de purificació del bioprocés. En aquesta s'analitzen les propietats del producte i del brou de cultiu, i s'avaluen dues estratègies de purificació. Aquestes es diferencien fonamentalment per la seva possibilitat de facilitar el canvi d'escala, de manera que es designen com a estratègia de purificació no escalable (basada en la ultracentrifugació) i escalable (basada en la cromatografia). La primera és comunament emprada a escala de laboratori; donat que es recull específicament la banda de densitat que conté el vector adenoviral, s'implementa per obtenir material amb una elevada puresa que serveixi com a referència a l'hora de comparar els resultats obtinguts amb l'estratègia escalable. Per portar a terme aquesta última, es dissenyen les operacions que la integren, i es determinen els paràmetres de purificació, entre ells el rendiment global de recuperació del producte final. Posteriorment, es realitza la caracterització del producte per determinar el seu grau de puresa. Els resultats obtinguts deixen palès que l'estratègia escalable presenta un rendiment global superior al de la no escalable, tot i que el grau de puresa aconseguit és inferior.
Les dades experimentals, tant de la producció com de la purificació, permeten disposar de quatre alternatives amb l'objectiu d'analitzar la potencial implantació del bioprocés a escala industrial. El disseny i la comparació de les mateixes es realitza d'acord amb el seu dimensionament seguint unes bases de disseny comunes, i la seva valoració final es projecta en termes econòmics. A partir dels resultats obtinguts, l'alternativa més aconsellable d'ésser portada a la pràctica és la basada en el bioprocés integrat pel sistema de producció no convencional operant en continu amb perfusió.
Aquesta memòria s'estructura, doncs, de manera que inicialment es fa una introducció (capítol 2), on es revisen les característiques de la teràpia gènica, dels vectors adenovirals i de les línies cel·lulars productores, així com del bioprocés i de l'estricta normativa de producció GMP que el regeix. Seguidament (capítol 3), es plantegen els principals objectius del treball. A continuació (capítol 4), es concentren els estudis previs que caracteritzen tant la línia cel·lular productora com la infecció amb el vector adenoviral. Al capítol 5, es presenta el desenvolupament de l'etapa de producció del bioprocés. Anàlogament, en el capítol 6, es desenvolupa l'etapa de purificació del mateix. En el capítol 7, es realitza l'anàlisi de procés de les alternatives sorgides. En el capítol 8, s'exposen les principals conclusions extretes del treball. Finalment, es presenten els materials i mètodes emprats (capítol 9), i s'afegeix l'apèndix (capítol 10), on es complementen alguns aspectes concrets d'aquest treball.; For the last two decades, gene therapy has allowed to bring up new approaches in personal medicine. Its goal is to cure illnesses through the introduction of genetic material to the nucleus of a target cell in order to allow, increase or suppress the expression of a specific gene with therapeutic purpose. The vector is the agent that plays the principal role in this mechanism. Among the possible types (viral and non viral), the adenoviral vector is one of the most important due to its pre-eminence in the current preclinical human assays.
The present work achieves the complete development of a bioprocess for the obtention of adenoviral vectors for gene therapy: it studies the different aspects that conform the bioprocess, and analyzes the industrial implementation of the best alternative.
As a starting point, previous studies are carried out for knowing the interaction of the adenoviral vectors with the existing producing cellular lines. Techniques are studied for culturing two cellular candidates: HEK293 (adherent) and HEK293S (non adherent). From the infection of both with the adenoviral vector, main parameters of the infective cycle are characterized, which allow to conclude that the cellular line HEK293S is more appropriate due to its higher productivity. These data provide the basis to develop the production of the bioprocess. This stage is based on the study of three fundamental factors that describe bioreaction (monitoring, culture strategy and production system), which are deeply analyzed. The oxygen uptake rate (OUR) method is developed to monitor the cellular activity during the phases of growth and infection. Later on, two culture strategies are evaluated: batch (reference stretegy) and perfusion (strategy that provides most similar conditions to those in vivo). Finally, the former factors apply to the analysis of the production system, in particular, with the utilization of two alternatives: the so called conventional system (stirred tank bioreactor Biostat Bplus) and the non conventional system (single use technology based Wave Bioreactor). From the results, it can be concluded that the perfusion strategy provides high cellular densities, increasing the productivity as well as the final viral concentration. On the other hand, some operational advantages of the non conventional system are outlined, in spite of losing the OUR measure.
In order to complete the work, the purification stage of the bioprocess is developed. The properties of the product and the culture broth are analyzed, and two strategies of purification are evaluated. These differ in the possibility of increasing scale, so they are designated as non scalable strategy (based on ultracentrifugation) and scalable strategy (based on filtration and chromatography). The first one is commonly used at laboratory scale; given that the final product contains specifically the adenoviral vector, it is implemented to obtain referencie material with high purity when comparing the obtained results with the scalable strategy. The last one is developed based on the design of several operations. The characterization of the final product is carried out to determined its purity. The obtained results conclude that the scalable strategy shows higher global yield than the non scalable one, even though the degree of purity achieved is lower.
The production and purification data allow to have four alternatives in order to analyze the potential implantation of the industrial bioprocess. The design and the comparison of these are carried out according to the same bases of design, and the final discussion is based on economical terms. From the results, the most advisable alternative of being brought to practice is the one based on the bioprocess operating in perfusion using the non conventional system.
This memory is structured so it initially contains an introduction (chapter 2), where the characteristics of gene therapy, adenoviral vectors and the producing cellular lines, as well as the bioprocess are outlined. Next (chapter 3), the main objectives of the work are described. Next (chapter 4), the previous studies that characterize the producing cellular line as well as the infection with the adenoviral vector are concentrated. In chapter 5, the development of the production stage is presented. Analogously, in chapter 6, the purification stage is developed. In chapter 7, the process analysis of the alternatives is carried out. In chapter 8, main conclusions extracted from the work are set forth. Finally, the materials and methods used (chapter 9) are shown, and the appendix (chapter 10) is added, where some aspects of this work are complemented.

Sistemes de monitoratge per a cultius de cèl·lules animals adherents desenvolupament i aplicacions em models cel·lulars i tissulars

Tue, 12 Apr 2011 14:47:18 GMT

Sistemes de monitoratge per a cultius de cèl·lules animals adherents desenvolupament i aplicacions em models cel·lulars i tissulars Sarró Casanovas, Enric El cultiu de cèl·lules animals és una tecnologia que disposa d'un gran potencial econòmic i social, cada cop més elevat degut a la pròpia importància de les aplicacions en les que es troben relacionats aquests productes, que es troba enfocat al descobriment, desenvolupament i ús de nous productes biotecnològics.
Degut a la major complexitat del cultiu de cèl·lules animals i a les limitacions que presenten envers els cultius de cèl·lules procariotes per a l'obtenció d'elevades concentracions cel·lulars, és necessari dotar el cultiu de cèl·lules animals de tecnologies que permetin optimitzar‐ne la seva expansió cel·lular i poder evitar l'actual suboptimització de la majoria dels processos de cultius de cèl·lules animals, que s'han basat en estratègies de cultiu simples (discontinu) i que limiten fortament les concentracions finals obtingudes. Un dels paràmetres clau en un cultiu de cèl·lules és la concentració cel·lular, essent la màxima concentració cel·lular un dels objectius primordials dels cultius cel·lulars a la fi de poder obtenir la màxima productivitat. No és estrany, doncs, que aquest paràmetre es consideri el més important a monitorar en línia per a aquest tipus de processos.
Tot i que la majoria de productes biotecnològics son produïts mitjançant cultius de cèl·lules animals que creixen en suspensió, cada cop existeix un ventall de productes més extens produït exclusivament per cèl·lules adherents, com per exemple quan una línia cel·lular adherent no s'ha pogut adaptar amb èxit cap a un cultiu en suspensió, quan el producte són les pròpies cèl·lules adherents, quan es tracta d'un producte viral o proteic que necessita dels tipus concrets de cèl·lules animals adherents o per a les tecnologies emergents de les cèl·lules mare i l'enginyeria tissular, on la majoria dels llinatges cel·lulars resultants són adherents.
La problemàtica però, recau en que moltes de les tecnologies que es troben desenvolupades actualment es varen focalitzar cap als cultius de cèl·lules animals en suspensió, mentre que els cultius de cèl·lules animals adherents es deixaven a banda. El fet que aquestes cèl·lules es trobin adherides formant una monocapa a la superfície del sistema de cultiu i no es trobin en suspensió, implica que les actuals metodologies i sensors comercials utilitzats pel seguiment de la concentració cel·lular en cultius de cèl·lules no adherents i que gaudeixen d'una bona sensibilitat, no siguin aplicables. A més a més, les mesures actuals que s'utilitzen pel monitoratge de cultius de cèl·lules adherents impliquen la utilització de mètodes destructius i fora de línia, obligant a la utilització de diversos cultius en paral·lel per a poder obtenir més d'un valor de concentració cel·lular al llarg d'un creixement cel·lular, amb la variabilitat que això significa.
Així doncs, en aquest treball s'ha abordat aquesta problemàtica, amb l'objectiu de desenvolupar i implementar unes tecnologies que permetin el seguiment, en línia, de la concentració cel·lular, ja sigui de forma directa o bé de forma indirecta, mitjançant la seva estimació a partir de la mesura de l'activitat cel·lular, i que pugui abraçar l'ampli ventall de línies cel·lulars existents que creixen en adherència i que disposen de característiques cel·lulars diferents (consums de nutrients, concentracions cel·lulars, necessitats en el medi de cultiu...).; The cultivation of animal cells is a technology that has great economic and social increasingly potentials, due to the very important applications in which these products are related, which are focused on the discovery, development and use of new biotechnology products.
Due to the greater complexity of the cultivation of animal cells and its limitations to obtain high cell concentrations when compared to prokaryotic cells, we must develop new technologies which permits the optimization of animal cell cultures in order to prevent the current suboptimitzation of most animal cell cultures processes, which are usually based on simple cultivation strategies (batch) that limit strongly the final obtained cell concentrations. One of the key parameters in cell culture is cell density being, the maximum cell density, one of the main objectives of cell cultures in order to obtain maximum productivity. It's for this reason that it is considered the most important parameter to monitor online.
Although most biotechnology products are produced by animal cells that grow in suspension cultures, the products produced exclusively for adherent cells are in constant increase, for example when an adherent cell line can't be successfully adapted to suspension cultures, when the product are the same adherent cells, when a required viral or protein product are only produced by specific types of adherent animal cells or for the emerging stem cell and tissue engineering technologies, where most of its related cell lines are adherent.
The problem however, lies in that many of the current technologies have been developed for suspension animal cells, while adherent animal cell lines were left aside. The fact that these adherent cells are attached to the surface forming a monolayer culture system and are not suspended in the medium, means that the current methodologies and commercial sensors with good sensibilities used to monitor cell concentration in suspension cell cultures, can't be used for adherent cells. In addition, the current measurements used to monitor adherent cell cultures involve the use of destructive offline methods, forcing the use of various cultures in parallel in order to obtain different measurements over a whole cell growth, with the variability that it means.
Thus, this work has been addressed to solve this problem with the objective to develop and implement some technologies that permits to online monitor of cell using direct methods and indirect methods through their estimation from the measurement of cellular activity, technologies which must permit to monitor cell concentration to the wide range of existing adherent cell lines with different cellular characteristics (nutrient uptake, final cell concentrations, needs in culture medium, etc.).

Enviromental impact analysis at full-scale OFMSW biological teatment plants. Focus an gaseous-emissions

Tue, 12 Apr 2011 14:47:18 GMT

Enviromental impact analysis at full-scale OFMSW biological teatment plants. Focus an gaseous-emissions Cadena Martínez, Erasmo

Industrial ecology as a discipline for the analysis and design of sustainable urban settlements

Tue, 12 Apr 2011 14:47:17 GMT

Industrial ecology as a discipline for the analysis and design of sustainable urban settlements Oliver i Solà, Jordi Malgrat representar només el 2,7% de la superfície del planeta, les ciutats del món són responsables del 75% del consum d'energia, i el 80% de les emissions de gasos d'efecte hivernacle.
Encara que el focus d'atenció per mitigar el canvi climàtic s'ha centrat en els combustibles alternatius, vehicles, i la generació d'electricitat; la millora del disseny urbà, representa una oportunitat important que sovint no es valora prou. Aquesta tesi estén l'anàlisi de l'Ecologia Industrial a l'avaluació ambiental de les obres civils en l'entorn urbà, incloent parcs de serveis en zones urbanes.
Pel que fa al sector serveis, el capítol II avalua, des de la perspectiva de l'Ecologia Industrial, l'eficiència energètica dels serveis dins del Parc urbà de Montjuïc i determina el seu impacte ambiental global. A més, aquest estudi determina quins són els serveis més intensius energèticament i analitza la seva eficiència per visitant o unitat de superfície.
El consum d'electricitat representa gairebé el 70% de l'energia total consumida pels serveis en el Parc de Montjuïc, i la superfície forestal necessària per absorbir les emissions de CO2 equivalent produïdes pel cicle de vida de l'energia consumida representa 12,2 vegades la superfície del Parc.
El capítol III analitza l'optimització ambiental de les voreres a les zones urbanes. Encara que una àmplia gamma de materials i solucions constructives estan disponibles per a la pavimentació de les voreres, aquest estudi es centra en tres solucions constructives de formigó molt comunes. Cada solució constructiva té característiques diferents que afecten la seva funcionalitat en: trànsit, característiques de la superfície, i manteniment.
Pel que fa a principals aportacions, aquest estudi fa una descripció general i proveeix l'inventari dels sistemes de vorera estudiats. Segons l'Anàlisi de Cicle de Vida (ACV), el sistema de panot és el que presenta valors més elevats d'impacte ambiental, tanmateix és el tipus de paviment de vorera més utilitzat en l'àrea d'estudi, degut principalment a les preocupacions estètiques i els imperatius del manteniment dels serveis urbans subterranis.
Restringir l'ús dels paviments de formigó per a vianants amb una major capacitat estructural a aquelles seccions de carrer que en realitat els exigeixen podria reduir els impactes ambientals fins un 73,8% a les àrees exclusives per vianants.
Els capítols IV i V utilitzen la metodologia de l'ACV per analitzar el tipus i origen dels impactes ambientals relacionats amb les xarxes de distribució de gas natural i calor.
Per a la xarxa de gas natural, els resultats mostren que l'impacte per habitatge en les categories ambientals estudiades és d'entre 1,9 i 4,8 vegades més gran en un barri de baixa densitat, en funció de la categoria d'impacte. A més, a les zones d'alta densitat el principal impacte s'origina a partir de components i materials relacionats amb els edificis i habitatges, mentre que en zones de baixa densitat el principal impacte s'origina a la xarxa de barri. Tenint en compte aquest últim resultat, s'avalua la conveniència de substituir la xarxa de barri per un sistema discontinu basat en tancs de propà. El resultat indica que quan es necessita una canonada de barri de més d'1 km per arribar a un usuari, és ambientalment preferible per a totes les categories d'impacte utilitzar el sistema de tancs de propà.
Per a la xarxa de distribució de calor, els resultats mostren que les fonts d'impacte no ubiquen especialment a la xarxa principal (menys del 7,1% de contribució a totes les categories d'impacte), que és el subsistema que ha centrat l'atenció en la literatura; sinó que aquest es troba a les plantes de generació energètica i als components dels habitatges. Aquests dos subsistemes contribueixen conjuntament entre un 40% i un 92% a l'impacte ambiental en funció de les categories d'impacte. Pel que fa als components, només un nombre reduït són responsables de la majoria dels impactes ambientals.
Com a conclusió general, l'enfocament de l'Ecologia Industrial aplicat als sistemes urbans, estudiant el metabolisme de les ciutats, barris, sectors econòmics o les infraestructures, proveeix de dades sobre el metabolisme dels sistemes urbans, assenyala els punts febles des d'una perspectiva ambiental i assenyala les oportunitats de millora dels nostres sistemes urbans. Per tant, l'Ecologia Industrial es converteix en el primer pas per orientar els processos de disseny ecològic a escala de barri o d'infraestructura.; A pesar de representar sólo el 2,7% de la superficie del planeta, las ciudades del mundo son responsables del 75% del consumo de energía, y el 80% de las emisiones de gases de efecto invernadero.
Aunque el foco de atención para mitigar el cambio climático se ha centrado en los combustibles alternativos, vehículos, y la generación de electricidad; la mejora del diseño urbano, representa una oportunidad importante que a menudo no se valora suficientemente. Esta tesis extiende el análisis de la Ecología Industrial en la evaluación ambiental de las obras civiles en el entorno urbano, incluyendo parques de servicios en zonas urbanas.
En cuanto al sector servicios, el capítulo II evalúa, desde la perspectiva de la Ecología Industrial, la eficiencia energética de los servicios dentro del Parque urbano de Montjuïc y determina su impacto ambiental global. Además, este estudio determina cuáles son los servicios más intensivos energéticamente y analiza su eficiencia por visitante o unidad de superficie.
El consumo de electricidad representa casi el 70% de la energía total consumida por los servicios en el Parque de Montjuïc, y la superficie forestal necesaria para absorber las emisiones de CO2 equivalente producidas por el ciclo de vida de la energía consumida representa 12,2 veces la superficie del Parque.
El capítulo III analiza la optimización ambiental de las aceras en las zonas urbanas. Aunque una amplia gama de materiales y soluciones constructivas están disponibles para la pavimentación de las aceras, este estudio se centra en tres soluciones constructivas de hormigón muy comunes. Cada solución constructiva tiene características diferentes que afectan a su funcionalidad en: tráfico, características de la superficie, y mantenimiento.
En cuanto a principales aportaciones, este estudio hace una descripción general y provee el inventario de los sistemas de acera estudiados. Según el Análisis de Ciclo de Vida (ACV), el sistema de pavimento hidráulico es el que presenta valores más elevados de impacto ambiental, sin embargo es el tipo de pavimento de acera más utilizado en el área de estudio, debido principalmente a las preocupaciones estéticas y los imperativos del mantenimiento de los servicios urbanos subterráneos.
Restringir el uso de los pavimentos de hormigón para peatones con una mayor capacidad estructural a aquellas secciones de calle que en realidad los exigen podría reducir los impactos ambientales hasta un 73,8% en las áreas exclusivas para peatones.
Los capítulos IV y V utilizan la metodología del ACV para analizar el tipo y origen de los impactos ambientales relacionados con las redes de distribución de gas natural y calor. Para la red de gas natural, los resultados muestran que el impacto por vivienda en las categorías ambientales estudiadas es de entre 1,9 y 4,8 veces mayor en un barrio de baja densidad, en función de la categoría de impacto. Además, en las zonas de alta densidad el principal impacto se origina a partir de componentes y materiales relacionados con los edificios y viviendas, mientras que en zonas de baja densidad el principal impacto se origina en la red de barrio. Teniendo en cuenta este último resultado, se evalúa la conveniencia de sustituir la red de barrio por un sistema discontinuo basado en tanques de propano. El resultado indica que cuando se necesita una tubería de barrio de más de 1 km para llegar a un usuario, es ambientalmente preferible para todas las categorías de impacto utilizar el sistema de tanques de propano.
Para la red de distribución de calor, los resultados muestran que las fuentes de impacto no se ubican especialmente en la red principal (menos del 7,1% de contribución en todas las categorías de impacto), que es el subsistema que ha centrado la atención en la literatura, sino que éste se encuentra en las plantas de generación energética y los componentes de las viviendas. Estos dos subsistemas contribuyen conjuntamente entre un 40% y un 92% al impacto ambiental en función de las categorías de impacto. En cuanto a los componentes, sólo un número reducido son responsables de la mayoría de los impactos ambientales.
Como conclusión general, el enfoque de la Ecología Industrial aplicado a los sistemas urbanos, estudiando el metabolismo de las ciudades, barrios, sectores económicos o las infraestructuras, provee de datos sobre el metabolismo de los sistemas urbanos, señala los puntos débiles desde una perspectiva ambiental y señala las oportunidades de mejora de nuestros sistemas urbanos. Por tanto, la Ecología Industrial se convierte en el primer paso para orientar los procesos de diseño ecológico a escala de barrio o de infraestructura.; Despite representing only 2.7% of the world's surface area, the world's cities are responsible for 75% of the world's energy consumption, and 80% of greenhouse gas emissions.
Although much attention on mitigating climate change has focused on alternative fuels, vehicles, and electricity generation, better urban design represents an important yet undervalued opportunity. This thesis extends the analysis of Industrial Ecology to the environmental assessment of civil works in the urban environment, including service estates in urban areas.
Concerning the service sector, chapter II evaluates, from an Industrial Ecology perspective, the energy performance of the services inside the Montjuïc urban park and determines their global environmental impact. Additionally, this study determines which are the most energy demanding services and the efficiency of their energy use per visitor and per surface area unit.
Electricity consumption represents nearly 70% of the total energy consumed by the services at Montjuïc Park. The forest surface area required to absorb the CO2-equivalent emissions produced by the life cycle of the energy consumed at Montjuïc Park represents 12.2 times the Park's surface area.
Chapter III analyzes the environmental optimization of concrete sidewalks in urban areas. Although a wide range of materials and constructive solutions are available for sidewalk paving, this study focuses on three very common concrete-based systems with different functionalities in terms of traffic, surface characteristics, and maintenance.
In terms of main findings, this study provides a comprehensive description and inventory of the sidewalk systems under study. According to the Life Cycle Assessment (LCA), the slab system has the highest environmental impacts; this happens to be the most widely used sidewalk type in the area studied, mainly due to aesthetic concerns and the imperatives of maintaining underground urban services. Regardless of the thickness of the concrete base, the slab system has the highest impact in all categories compared with the other two sidewalk types.
Restricting the use of concrete sidewalks with high structural capacity to street sections that actually require them could reduce environmental impacts by up to 73.8% in pedestrian-only areas.
Chapters IV and V use the LCA methodology to analyze the type and origin of environmental impacts related to natural gas and district heating distribution networks.
For the natural gas network the results show that the impact per dwelling in the environmental categories studied is between 1.9 and 4.8 times higher in a low density neighborhood, depending on the impact category. Besides, in high density areas the main impact originates from components and materials related to the buildings and dwellings, whereas in low density areas the main impact originates on the neighborhood network. Given this last result, the advisability of substituting the neighborhood network by a discontinuous system based on propane tanks has been evaluated, obtaining as a result that when a single neighborhood pipe, longer than 1 km, is required to reach one user, it is environmentally preferable for all the studied environmental categories to use the propane tank system.
For the district heating network, the results show that the sources of impact are not particularly located in the main grid (less than 7.1% contribution in all impact categories), which is the focus of attention in the literature, but in the power plants and dwelling components. These two subsystems together contribute from 40% to 92% to the overall impact depending on the impact categories. Concerning the components, only a reduced number are responsible for the majority of the environmental impact.
As a very general conclusion, the Industrial Ecology approach applied to urban systems, studying the metabolism of the cities, neighborhoods, economic sectors or infrastructures, provides clarifying data about the metabolism of urban systems; identifies the environmental flaws and improvement opportunities of our urban systems and becomes the first step for guiding ecodesign processes on an infrastructural or neighborhood scale.

Avances en el desarrollo de bioprocesos: adición aldólica catalizada por ramnulosa-1-fosfato aldolasa recombinante

Tue, 12 Apr 2011 14:47:16 GMT

Avances en el desarrollo de bioprocesos: adición aldólica catalizada por ramnulosa-1-fosfato aldolasa recombinante Ardao Palacios, Inés En la actualidad existe un creciente interés en el desarrollo de procesos industriales biocatalíticos eficientes desde el punto de vista económico y medioambiental. Uno de los procesos más prometedores para la industria es la biocatálisis de la formación de enlaces C-C para la producción de compuestos de estereoquímica definida, de aplicación en diversos campos y, en especial, en la industria farmacéutica.
El presente trabajo de Tesis Doctoral es una aportación al desarrollo de un bioproceso catalítico empleando ramnulosa-1-fosfato aldolasa recombinante como biocatalizador para la producción estereoselectiva de un compuesto precursor de inhibidores de glicosidasas de acción terapéutica mediante adición aldólica de dihidroxiacetona fosfato y (S)-Cbz-alaninal.
En primer lugar, se ha procedido a la obtención de un modelo cinético de la reacción catalizada por la enzima soluble en un medio acuoso con dimetilformamida como cosolvente para permitir la disolución simultánea de ambos reactivos. Este modelo cinético incluye la reacción secundaria de degradación enzimática de dihidroxiacetona fosfato que tiene lugar paralelamente a la reacción de síntesis.
En segundo lugar, y con el fin de aumentar la estabilidad de la enzima y mejorar la operación en biorreactor, se estudió la inmovilización de la enzima en dos tipos de soportes: soportes de afinidad metálica y nanopartículas de oro. El primer soporte permite realizar la purificación e inmovilización en un solo paso de la enzima, con el consiguiente ahorro de etapas y aumento del rendimiento global del proceso. El segundo tipo de soporte permite reducir las limitaciones difusionales que aparecen con frecuencia en los soportes porosos convencionales y obtener elevadas cargas enzimáticas específicas. Los biocatalizadores inmovilizados por ambas técnicas se emplearon en la catálisis de la adición aldólica de interés en un medio acuoso con dimetilformamida como cosolvente, evaluando su estabilidad en el medio.
Por último, se estudiaron otras estrategias de reacción para mejorar la solubilidad simultánea de los reactivos de la reacción. Por un lado se analizó el empleo de novedosos medios de reacción, los líquidos iónicos, como alternativa al empleo de cosolventes orgánicos en la biocatálisis de interés. Por otro lado, se evaluó la aplicación de un biorreactor de membrana empleando un medio bifásico acuoso/orgánico en el mismo sistema biocatalítico.; Nowadays, there is a growing interest in the development of efficient industrial bioprocesses from an economic and environmental point of view. One of the most promising processes for the industry is the biocatalytic C-C bond formation that yields compounds with defined stereochemistry for diverse applications, especially in the pharmaceutical industry.
This PhD Thesis is a contribution to the development of a catalytic bioprocess for the production of precursors of compounds with therapeutic potential as inhibitors of glycosidases for a wide range of diseases. The biocatalytic reaction employed was the aldol addition between dihydroxyacetone phosphate and (S)-Cbz-alaninal using recombinant rhamnulose-1-phosphate aldolase as biocatalyst.
First, a kinetic model for the aldol addition catalyzed by soluble enzyme was obtained. The reaction was carried out in an aqueous medium with dimethylformamide as a cosolvent in order to achieve a suitable solubility of both reactants. This kinetic model includes the secondary reaction of enzymatic degradation of dihydroxyacetone phosphate that takes place simultaneous to the synthetic reaction.
Secondly, enzyme immobilization was studied with the aim of increasing enzyme stability and improving bioreactor operation. Two types of supports were used: metal-chelated supports (IMAC) and gold nanoparticles. The use of metal-chelated supports allows simultaneous purification and immobilization in only one-step, reducing the number of steps of the process and increasing the global yield. Gold nanoparticles as supports for enzyme immobilization allow obtaining high enzymatic loads due to its high surface-to-volume ratio. Moreover, the diffusional limitations that frequently appear while working with conventional porous supports can be also reduced. Immobilized biocatalysts were produced by both immobilization techniques and they were applied in the biocatalysis of the selected aldol addition in an aqueous medium with dimethylformamide as a cosolvent. The stability of these biocatalysts in the reaction conditions was determined as well.
Finally, other reaction strategies were employed in order to improve the simultaneous solubility of dihydroxyacetone phosphate and (S)-Cbz-alaninal. Ionic liquids, considered as promising reaction solvents, were assessed as an alternative to organic cosolvents in the selected biocatalysis. On the other hand, a membrane bioreactor with an aqueous/organic biphasic medium with high solubility of both substrates was studied with the same biocatalytic system.

Producció recombinant de la gonadotrofina coriònica equina amb el llevat Pichia pastoris

Tue, 12 Apr 2011 14:47:16 GMT

Producció recombinant de la gonadotrofina coriònica equina amb el llevat Pichia pastoris Ubach Font, Anna En aquest estudi es presenta el procés d'obtenció d'una proteïna recombinant, l'hormona gonadotrofina coriònica equina (eCG) en el llevat metilotròfic Pichia pastoris.
S'ha sintetitzat els gens mitjançant la tècnica de PCR, ja que les seqüències són relativament curtes, 294 i 472 nucleòtids pels gens codificadors de la cadena α i β, respectivament. Això ha permès poder modificar la seqüència per tal d'adaptar-la a l'ús codons més utilitzats per P. pastoris, eliminar i afegir dianes de restricció per facilitar el clonatge, eliminar la seqüència senyal pròpia i treure els introns que conté la seqüència genòmica de la cadena β.
D'acord amb la seqüència de DNA optimitzada obtinguda s'han dissenyat una sèrie d'oligonucleòtids amb una petita part de seqüència solapada que serviran per la síntesi de cada un dels dos gens. La tècnica de PCR ha permès la fusió d'aquests oligonucleòtids per obtenir els dos gens, els quals s'han clonat al plasmidi d'expressió pPICZα sota el control del promotor AOX.
A partir dels plasmidis que contenen només un dels dos gens s'han obtingut dues construccions que contenen els dos cassets d'expressió en els dos ordres possibles: pPICZα-eCGα+β i pPICZα-eCGβ+α.
S'han obtingut cinc transformants amb cada construcció, se n'ha avaluat la seva capacitat productiva amb cultius en erlenmeyer i una transferència de punts. S'han fet cultius en discontinu i en discontinu alimentat per produir suficient hormona per poder desenvolupar un procés de purificació i poder caracteritzar parcialment l'hormona recombinant.
La cua de 6 histidines present en la cadena α hauria de permetre fer una purificació en un sol pas amb una cromatografia d'afinitat amb metalls quelants, però no ha estat així; la proteïna era incapaç d'unir-se a la resina i per tan, no s'ha pogut separar de la resta de proteïnes del brou mitjançant aquesta tècnica.
Per això s'ha plantejat un procés de purificació més complex, tot i que s'ha procurat minimitzar-ne el nombre d'etapes. La concentració inicial del brou obtingut permet treballar amb volums més reduïts. Segueix una diafiltració que permet disminuir l'alt contingut en sals del brou de cultiu i tenir la proteïna en un tampó estàndard. D'aquesta manera també s'han eliminat les proteïnes de pes molecular més petit de 10 kDa.
Segueixen dues etapes de cromatografia, la primera de bescanvi iònic i la segona ha estat de sedàs molecular. Amb aquest procés s'ha aconseguit un producte final suficientment pur, tot i que alguns dels resultats de la caracterització apunten que encara hi pot haver quedat alguna proteïna no desitjada de propietats físico-químiques molt semblants a la eCG.
S'ha caracteritzat, breument, l'hormona recombinant parcialment purificada, comparant-la amb l'hormona nativa. S'ha determinat el pes molecular, el punt isoelèctric i el grau de glicosilació.
Amb una preparació de eCG recombinant en solució salina s'han fet les proves d'activitat in vitro, que han donat positives i d'activitat in vivo, que han donat negatives.
Així doncs, podem dir que s'ha aconseguit produir l'hormona eCG amb el llevat P. pastoris, tot i que falta perfeccionar el procés de purificació per a obtenir-la en quantitat i qualitat adequada.; In this study, the process of obtaining the recombinant protein equine Chorionic Gonadotrophin hormone (eCG) in the methylotrophic yeast Pichia pastoris is presented.
The genes have been synthesized through the technique of PCR, since the sequences are relatively short, 294 and 472 nucleotides for the genes coding the alpha and beta chain, respectively. This has allowed to modify the sequence in order to adapt the sequence to the more used by P. pastoris, to eliminate and to add targets of restriction to improve the cloning, to eliminate the own signal sequence and to remove the introns that the genomic sequence contains.
In accordance with the optimized sequence of DNA, we design four oligonucleotides for each chain, with a small part of overlapped sequence that will serve for the synthesis of each alpha and beta gene. The technique of PCR has allowed the fusion of these oligonucleotides. The genes have been cloned in pPICZα, a expression plasmid where the expression is under the control of the promoter AOX.
From the plasmids that content only one of the genes, we construct the plasmids that content both cassettes of expression in the two possible orders: pPICZ-eCGα+β and pPICZ-eCGβ+α.
Five transformants have been obtained with each construction, its productive capacity with erlenmeyer culture has been estimated.
Cultures have been made in batch and in fed-batch for producing enough hormone for being able to develop a process of purification and being able to characterize partially the recombining hormone.
The presents of 6 histidines tag in the alpha chain should allow to make a purification in one step by an affinity chromatography, but it has not been possible; the protein was incapable of joining to the resin and for so, it has not been able to break away from the rest of proteins of the broth.
Because of that, a process of purification more complex has been brought up; even though it has been tried to minimize the number of stages. The initial concentration of the broth allows to work with more reduced volumes. A diafiltration allows to reduce the high concentrations of salts from the medium culture and to have the protein in a standard buffer. In this way also the proteins of smaller molecular weight (10 kDa) have been eliminated.
Two stages of chromatography follow the concentration; the first is a ionic exchange and the second is a gel-filtration chromatography. With this process a final product pure enough has been achieved, even though some of the results of the characterization aim that some protein is not eliminated, a protein with Physico-chemical properties very similar to the eCG.
The recombinant hormone partially purified is briefly characterized and it is compared with the native hormone. The molecular weight, the isoelèctric point and the degree of glycosylation have been determinate. With the same recombinant hormone the in vitro and in vivo activity has been analyzed, the first one gives us a positive result but not the second one.
So, we can say that it has been achieved to produce the hormone eCG with the yeast P. pastoris, even though an improve of the process of purification in needed to obtain a recombinant product in a suitable quality.

Millora en el procés de producció d'una lipasa de Rhizopus oryzae en Pichia pastoris mitjançant tècniques de monitoratge i estratègies de cultiu alternatives

Tue, 12 Apr 2011 14:47:15 GMT

Millora en el procés de producció d'una lipasa de Rhizopus oryzae en Pichia pastoris mitjançant tècniques de monitoratge i estratègies de cultiu alternatives Surribas i Casalprim, Anna En aquest treball s'exposen dues línies de recerca centrades en el procés de producció d'una lipasa de Rhizopus oryzae (ROL) en Pichia pastoris: la utilització de diferents tècniques de monitoratge i l'aplicació d'estratègies de cultiu que permetin millorar la producció de la ROL en una soca Mut+ d'aquest sistema d'expressió.
En els cultius discontinus alimentats amb P. pastoris cal disposar d'una mesura en línia i en temps real de la concentració de substrat, el metanol. Per això es va desenvolupar un analitzador d'injecció seqüencial. Es va comprovar que aquest té una freqüència d'anàlisi òptima per a cultius amb la soca Muts però baixa per a la soca Mut+. Amb aquesta última soca, es van utilitzar i comparar dos mesuradors comercials en fase gas.
Es va avaluar també la fluorimetria com a tècnica de monitoratge per a la determinació de tres variables clau: la biomassa, el substrat (glicerol/metanol) i la proteïna recombinant.
Inicialment es va fer un seguiment de l'evolució de la biomassa a partir del senyal de fluorescència off-line del triptòfan. Es pot predir la biomassa correctament però es van evidenciar diferents desavantatges: la necessitat de dilució de les mostres i d'un sistema de presa de mostra específic. Per això es va decidir aplicar i avaluar la fluorimetria multivariable in situ.
Amb la utilització d'una sonda fluorimètrica in situ, combinada amb mètodes quimiomètrics de tractament de dades multivariables, es va aconseguir predir la biomassa i el substrat a partir de la determinació del senyal de diversos fluoròfors. No es va aconseguir una bona predicció de la producció de ROL.
Per millorar el seguiment de la proteïna, es va fusionar a la GFP. Es van detectar dos inconvenients: els nivells de producció disminuïen respecte a la producció de ROL únicament i la riboflavina, que Pichia excreta al medi, interferia amb el senyal de fluorescència del mutant de GFP escollit. Tant amb la filtració de la mostra abans de la determinació del senyal de GFP com si s'hagués escollit un mutant de GFP amb emissió més allunyada de la riboflavina es podria haver evitat aquest inconvenient i fer un seguiment de la ROL excretada. Es pot seguir la ROL intracel·lular.
Quant a la producció de la ROL, es va estudiar l'efecte del nivell de metanol residual en cultius discontinus alimentats amb la soca Mut+. Existeix una concentració òptima entorn els 2.5 g·l-1 de metanol al medi. A concentracions superiors es va apreciar inhibició per substrat. Es va observar un fenomen de limitació per transferència d'oxigen al final del cultiu i una important disminució de la viabilitat cel·lular.
Per això, es van avaluar estratègies de cultiu alternatives. Primer es va aplicar una estratègia de metanol limitant (MLFB) per evitar la limitació d'oxigen al final d'un cultiu a 2.5 g·l-1 de metanol residual (MNLFB). Es va millorar la productivitat un 40%. En segon lloc, es va aplicar una estratègia de temperatura limitant per avaluar el seu efecte sobre la producció. No es van millorar els resultats. Finalment, es va aplicar una estratègia MNLFB a 2.5 g·l-1 de metanol però amb un medi amb una menor osmolaritat i una fase final amb limitació de temperatura per evitar la limitació d'oxigen. Es va aconseguir reduir la mortalitat cel·lular però la productivitat disminuïa respecte el cultiu on s'aplica una fase de MLFB al final de la inducció. Tot i això, es va obtenir un producte final un 30% més pur en quant a activitat lipolítica respecte la proteïna total.
Posteriorment es va procedir a escalar la producció en planta pilot. Es va observar limitació en la transferència d'oxigen en fases inicials de la inducció. Això va originar l'aparició d'un subproducte, associat a una reducció en la producció de ROL extracel·lular. En millorar la transferència d'oxigen es va minimitzar aquesta limitació i va millorar la producció. No es van aconseguir els mateixos nivells de productivitat que a escala laboratori però es continua treballant en la millora de la transferència de matèria per assolir-los.; In this work two research lines, applied to the production of a Rhizopus oryzae lipase (ROL) in Pichia pastoris, are shown: the application of different monitoring and cultivation techniques to improve ROL production in a P. pastoris Mut+ strain.
During P. pastoris fed-batch cultures, methanol needs to be on line measured and monitored in real time. For this purpose, a sequential injection analyzer was developed. Although it presented a suitable analysis frequency for a Muts strain it was too low for a Mut+ strain. When the later was used, two different methanol commercial sensors in the outlet gas steams were utilized and compared.
Fluorometry was also evaluated as a monitoring technique for three key variables: biomass, substrate (glycerol/methanol) and recombinant protein.
Initially, biomass was followed by the off-line determination of tryptophan's fluorescence. Biomass was correctly predicted with this system but different disadvantages appeared: the need of a sample dilution procedure and a specific sampling device. Therefore, multivariable in situ fluorometry was subsequently evaluated.
By means of an in situ multivariable fluorimetric probe, combined with chemometric methods to data processing, biomass and substrate prediction was properly achieved. ROL production could not be satisfactorily estimated.
To improve ROL monitoring, it was fusioned to the green fluorescent protein (GFP). Two main disadvantages were found: production levels were lower when compared to solely ROL expression and riboflavin, naturally excreted by the yeast, interfered to GFP's signal. This problem could be solved with sample filtration prior to GFP's measurement and also if a different GFP mutant had been chosen with emission signal further to riboflavin's.
With respect to ROL production, the effect of methanol concentration was studied in Mut+ fed-batch cultures. There is an optimal methanol concentration about 2.5 g·l-1. Substrate inhibition was observed at higher methanol levels. Oxygen transfer limitation at the end of the induction phase and an important cell viability decrease were also found.
Therefore, alternative culture techniques were evaluated. First a methanol limited fed-batch phase (MLFB) was applied when oxygen limitations appeared at the end of a 2.5 g·l-1 methanol fed-batch phase (MNLFB). Productivity increased up to 40% with this strategy. Secondly, a temperature limited fed-batch was applied. No better results were obtained compared to the reference MNLFB culture. Finally, a 2.5 g·l-1 methanol fed-batch was applied with a lower salt content medium and a final temperature limited phase when oxygen limitation appeared. Cell death was reduced but productivity decreased with respect to the reference MNLFB culture. However, a 30% purer lipase was obtained in terms of lipase activity to total protein.
Thereafter, the scaling of the production process in a pilot plant was evaluated. Oxygen limitation was found in the early induction phase. This caused a byproduct secretion associated to a ROL production decrease. When oxygen transfer was enhanced, byproduct secretion was reduced and ROL production improved. Similar laboratory scale productivities were not achieved but oxygen mass transfer is being further enhanced to reach the objective levels.

Mathematical modelling and molecular analysis of a nitrifying packed bed biofilm reactor

Tue, 12 Apr 2011 14:47:14 GMT

Mathematical modelling and molecular analysis of a nitrifying packed bed biofilm reactor Montràs Boet, Anna MELiSSA (Micro Ecological Life Support System Alternative) és el sistema desenvolupat per l'Agència Espacial Europea (ESA) i el consorci MELiSSA en el camp del suport de vida durant missions de llarga durada a l'espai. Basat en un ecosistema aquàtic, MELiSSA va ser concebut com una eina per desenvolupar la tecnologia necessària per a un sistema de suport de vida biològic que en un futur ha de permetre la producció d'aliment, aigua i oxigen a partir dels residus orgànics generats per una tripulació.
Per assolir aquest objectiu, el concepte MELiSSA compta amb l'activitat combinada de cinc compartiments colonitzats per diferents microorganismes i plantes superiors, interconnectats entre ells. Aquesta tesi es centra en el tercer compartiment del bucle MELiSSA, en el qual l'amoni és convertit a nitrat, que és la font de nitrogen més adequada per al creixement dels cianobacteris i plantes superiors que colonitzen els compartiments fotosintètics.
L'oxidació biològica d'amoni a nitrat té lloc en dues etapes successives que porten a terme dos tipus de soques bacterianes. En el projecte MELiSSA aquest procés es porta a terme en una columna de llit fix mitjançant Nitrosomonas europaea i Nitrobacter winogradkyi immobilitzats sobre un suport polimèric, i amb aportació d'aire en el mateix sentit de circulació que el medi líquid. El reactor pilot del tercer compartiment ha estat operant a la planta pilot del projecte MELiSSA durant períodes prolongats de temps abans de l'inici del treball realitzat en aquesta tesi.
La principal aportació d'aquesta tesi es troba en l'obtenció de nova informació sobre el funcionament del reactor a través d'un estudi detallat de la biopel·lícula i també mitjançant el desenvolupament d'un model matemàtic que ens permetrà estudiar els efectes de diferents paràmetres d'operació sobre el procés i l'estructura de la biopel·lícula. S'implementaran també els aparells de mesura necessaris per millorar la qualitat de la monitorització de les diferents espècies de nitrogen a la fase líquida. Els coneixements adquirits en la realització d'aquest treball seran utilitzats per portar a terme el re-disseny del reactor per tal de millorar-ne el funcionament dins de la planta pilot del projecte MELiSSA.; MELiSSA (Micro Ecological Life Support System Alternative) is the system developed by the European Space Agency (ESA) and the MELiSSA consortium in the field of life support for long term manned missions in Space. Based on the principle of an aquatic ecosystem, MELiSSA was conceived as a tool to develop the required technology for a future biological life support system. Its final aim is the production of food, fresh water and oxygen from the organic wastes of a crew.
To achieve this goal, the MELiSSA concept is based on the use of five interconnected compartments colonised by several microorganisms and higher plants. This thesis is focused on the third compartment of the MELiSSA loop, in which ammonium is converted to nitrate, the most suitable nitrogen source for the growth of the bacteria and higher plants colonising the photosynthetic compartment. The biological oxidation of ammonium to nitrate, which consists of two successive reactions carried out by two different bacterial strains, takes place in a packed bed biofilm reactor. Nitrosomonas europaea and Nitrobacter winogradskyi are immobilised on a polymeric support, with air flowing cocurrently with the feed medium. The pilot-scale reactor of compartment III (CIII) had been in operation in the MELiSSA pilot plant for several years before the start of the present work.
The main contributions of this thesis are in increasing the understanding of the reactor performance by studying the nitrifying biofilm in depth, and by developing a mathematical model that allows the effects of different operational parameters on the process and on the biofilm structure, to be studied. Moreover, continuous monitoring of the nitrifying efficiency will be improved by installing the necessary on-line equipment to experimentally measure the concentrations of all the nitrogen species in the liquid phase. The additional knowledge achieved on the reactor performance via this work will finally lead to re-design the reactor hardware for optimal performance in the MELiSSA pilot plant.
The knowledge acquired in this thesis was finally used to define the main features of the re-design of the pilot reactor of the MELiSSA compartment III.

Development of recombinant aldolase production process in Escherichia coli

Tue, 12 Apr 2011 14:47:13 GMT

Development of recombinant aldolase production process in Escherichia coli Pinsach i Boada, Jaume Aquest treball s'ha centrat en el desenvolupament del procés de producció d'aldolases recombinants en Escherichia coli.
D'una banda, el procés de producció de fuculosa 1-fosfat aldolasa (FucA) recombinant va ser automatitzat utilitzant un sistema d'expressió basat en un promotor feble induïble per IPTG. Donat que la inducció en forma de pols no afectava de forma significativa el metabolisme cel·lular fins que s'havia assolit un alt rendiment de producte, es va implementar un control robust del procés mitjançant l'automatització d'alimentació exponencial de substrat. Es van obtenir cultius d'alta densitat cel·lular controlant la velocitat específica de creixement a nivells de substrat limitants. El llaç de control utilitzat es va basar en l'estimació indirecta de la biomassa (utilitzant l'anàlisi dels gasos de sortida) i balanços de matèria.
D'altra banda, es va desenvolupar el procés de producció de ramnulosa 1-fosfat aldolasa (RhuA) recombinant utilitzant un sistema d'expressió basat en un promotor fort induïble per IPTG. Estudis preliminars d'expressió obtinguts en cultius en erlenmeyer van indicar que l'ús d'un promotor fort presentava importants avantatges. En comparació amb el sistema d'expressió basat en un promotor feble, es van obtenir alts rendiments de producte en terminis més curts i amb menors requeriments d'inductor. No obstant això, el sistema va resultar ser extremadament sensible a la inducció en cultius d'alta densitat cel·lular. Per tant, es va prestar especial atenció al desenvolupament de les estratègies de procés més adients.
En primer lloc, el desenvolupament del procés es va centrar en l'aplicació estratègies d'inducció alternatives en cultius d'alta densitat cel·lular. Tot i que en els estudis preliminars d'expressió s'havien aconseguit elevades activitats específiques, es van mesurar valors inferiors en cultius d'alta densitat cel·lular induïts amb polsos d'IPTG. Les condicions que provocaven un xoc metabòlic a les cèl·lules es van identificar i evitar mitjançant l'aplicació d'una estratègia d'addició contínua d'inductor. Aquesta estratègia va permetre la modulació de la velocitat d'expressió de la proteïna, de tal manera que la durada de la fase de producció es va estendre, els requeriments d'inductor van disminuir i es van assolir elevats rendiments de producte. Tot i això, els resultats encara indicaven una menor activitat específica de l'enzim que en el cas dels estudis preliminars d'expressió.
Disminucions de l'activitat enzimàtica s'han atribuït sovint a l'estrès degut a un excés de temperatura (ja sigui traduït en un mal plegament de la proteïna i/o a proteòlisi en sí), de tal manera que es va dur a terme l'optimització de la temperatura del procés. En aquestes condicions es van mesurar velocitats de producció específiques més baixes, però es va aconseguir millorar significativament els rendiments de RhuA activa.
També es van dur a terme estudis preliminars de modelització del procés. Tot i que no va ser possible calibrar un model de producció prou robust com per descriure totes les situacions que podrien ocórrer (i, per tant, l'optimització matemàtica de l'estratègia del procés no seria fiable), els estudis van permetre la identificació dels aspectes més importants del procés així com dels colls d'ampolla d'aquest.
Aquesta informació va permetre desenvolupar una estratègia de creixement alternativa amb l'objectiu de reduir l'estrès cel·lular degut a la limitació de substrat. Mitjançant el control dels nivells de glucosa al bioreactor, es van obtenir cultius d'alta densitat cel·lular a nivells de substrat inhibitoris per evitar l'acumulació d'acetat. Després de l'optimització de l'estratègia d'inducció, es van obtenir alts rendiments de producte així com una elevada activitat específica de l'enzim.
Finalment, es va realitzar un anàlisi global del procés de producció. Donat que l'objectiu era obtenir un enzim immobilitzat per ser utilitzat com biocatalitzador, les diferents estratègies de producció van ser comparades tenint en compte el seu impacte en les etapes posteriors de purificació i immobilització. Els resultats van mostrar que les estratègies alternatives de procés que s'havien desenvolupat en aquest treball augmentaven significativament els rendiments específics de RhuA immobilitzada activa respecte a l'anterior estratègia. Aquests resultats van posar de manifest la necessitat d'optimitzar la producció de proteïnes recombinants considerant tant el procés de producció com les fases posteriors de purificació i immobilització conjuntament.; This work has been focused on the development of recombinant aldolase production process in Escherichia coli.
On the one hand, the production process of recombinant fuculose 1-phosphate aldolase (FucA) was automated when using an expression system based on an inducible weak promoter. Since pulse induction did not significantly affect the host cell metabolism until high product yields were reached, a robust process control could be implemented by automating an exponential substrate feed. High cell density cultures were obtained at limiting substrate levels by controlling the specific growth rate. The implemented control algorithm used a simple feedback loop based on indirect biomass estimation (using exhaust gas analysis) and mass balances.
On the other hand, the production process of recombinant rhamnulose 1-phosphate aldolase (RhuA) using an expression system based on an inducible strong promoter was developed. Results obtained from preliminary expression studies performed in shake flask cultures indicated that the use of a strong promoter presented important advantages. When compared to the expression system based on a weak promoter, high product yields were obtained in shorter times, and lower amounts of inducer were required. However, when going to high cell density cultures, the system was found to be extremely sensitive to induction. Thus, special attention was paid on the development of suitable process strategies.
First, process development was focused on the implementation of alternative induction strategies in high cell density cultures. While high intracellular specific activities were achieved in shake flasks, lower specific values were measured in standard pulse-induced fed-batch cultures. The conditions under which high metabolic load on host cells compromised the productivity of the process were identified and avoided by implementing a continuous inducer addition strategy. When tuning protein expression rates, the length of the production phase was extended, the requirements of inducer were decreased and high product yields were achieved. However, results still showed lower specific enzyme activity than in the case of preliminary expression studies.
Since decreased enzyme activity has been often attributed to temperature-driven stress (translated into either protein misfolding and/or proteolysis itself), optimisation of process temperature was carried out. Lower specific production rates were measured at a reduced process temperature, but significant improvement was achieved in terms of bioactive RhuA yields.
Besides, preliminary studies on process modelling were carried out. Even though it was not possible to calibrate a production model robust enough to describe all situations which could potentially occur (and, thus, mathematical optimisation of the process strategy would not be reliable), insight of the process was gained, and some of the process bottlenecks and unknown key features were identified.
From these learnings, an alternative growth strategy was then developed to minimise the starvation induced-stress on host cells. High cell density cultures were obtained at non-limiting substrate levels by controlling the glucose concentration in the culture at inhibiting values to avoid acetate accumulation. After optimising the induction strategy, high product yields as well as high specific enzyme activities were obtained.
Finally, an analysis of the global production process was performed. Since the aim of the whole process was to obtain an immobilised enzyme ready to be used as biocatalyst, all different production strategies were compared taking into account their impact on downstream yields. When doing so, results showed that the alternative process strategies which had been developed in this work significantly increased the immobilised specific yields of active RhuA with respect to the previous strategy. These results reinforced the need to optimise recombinant protein production processes considering both the production and downstream stages as a whole.

Estratègies d'operació en el procés de producció de proteïnes heteròlogues en Pichia pastoris: aplicació de tècniques de monitorització i control

Tue, 12 Apr 2011 14:47:13 GMT

Estratègies d'operació en el procés de producció de proteïnes heteròlogues en Pichia pastoris: aplicació de tècniques de monitorització i control Ramon Real, Ramon El desenvolupament de bioprocessos productius reproduïbles i escalables s'ha convertit en un dels colls d'ampolla a mesura que es consolida l'obtenció de proteïnes recombinants. Per poder superar-ho, la FDA i la EMEA han posat en marxa la iniciativa Process Analytical Technologies (PAT) que cerca el desenvolupament de processos productius eficients i controlats i que serveix de marc pel desenvolupament del present treball.
El treball desenvolupat te com a objectiu el desenvolupament i implementació d'eines que permetin monitoritzar i controlar els processos de producció amb el llevat metilotròfic P. pastoris.
Aquest objectiu es materialitza en forma de un desenvolupament d'eines per la correcta monitorització de paràmetres i variables associats al procés productiu, com són el desenvolupament d'un sistema automàtic de presa de mostra, el desenvolupament d'eines per a l'eliminació d'interferències per un sensor en línea de metanol, el desenvolupament d'un sistema en línea de compostos amínics i el desenvolupar un software sensor que permeti determinar en línea la velocitat específica de creixement de P. pastoris en base a un algoritme d'identificació RLS. A més a més, s'ha implementat un sistema de control per a poder analitzar l'efecte de la concentració de metanol en una soca de fenotip Mut+ de P. pastoris sobre la productivitat del procés productiu i posteriorment s'ha avaluat l'efecte de la utilització de substrats mixtes per a la producció de proteïnes recombinants pels fenotips Muts i Mut+ de P. pastoris.
Paraules clau
Discontinu alimentat, Pichia pastoris, substrats mixtes, bioprocés, control, optimització, RLS; El desarrollo de bioprocesos productivos reproducibles y escalables se ha convertido en uno de los cuellos de botella a medida que se consolida la obtención de proteínas recombinantes. Para poder superarlo, la FDA y la EMEA han puesto en marcha la iniciativa Process Analytical Technologies (PAT) que busca el desarrollo de procesos productivos eficientes y controlados y que sirve de marco para el desarrollo del presente trabajo.
El trabajo desarrollado tiene como objetivo el desarrollo e implementación de herramientas que permitan monitorizar y controlar los procesos de producción de la levadura metilotrófica P. pastoris.
Este objetivo se materializa en forma de un desarrollo de herramientas para la correcta monitorización de parámetros y variables asociadas al proceso productivo, como son el desarrollo de un sistema automático de toma de muestra, el desarrollo de herramientas para la eliminación de interferencias para un sensor en línea de metanol, el desarrollo de un sistema en línea de medida de la concentración de compuestos amínicos y el desarrollo de un software sensor que permita determinar en línea la velocidad específica de crecimiento de P. pastoris en base a un algoritmo de identificación RLS. Además, se ha implementado un sistema de control para poder analizar el efecto de la concentración de metanol en una cepa de fenotipo Mut+ de P. pastoris sobre la productividad del proceso productivo y posteriormente se ha evaluado el efecto de la utilización de sustratos mixtos en la producción de proteínas recombinantes para los fenotipos Muts y Mut+ de P. pastoris.
Palabras Clave
Discontinuo alimentado, Pichia pastoris, substratos mixtos, bioproceso, control, optimización, RLS; The development of reproducible and scalable productive bioprocesses has become one of the bottlenecks for the production of recombinants proteins. In order to overcome it, the FDA and the EMEA have started off the Process Analytical Technologies (PAT). That initiative looks for the development of efficient and controlled productive processes and is in this concept where the present work is framed.
The goal of this experimental work is the development and implementation of tools that allow monitorization and control of P. pastoris production processes.
This goal is materialized with the creation and implementation of tools for the correct monitorization of parameters and state variables of the productive process, such as the development of an automatic sampling system, the development of tools for the elimination of interferences of an on-line methanol sensor, the development of an amine compounds analyzer and the development of a sensor software that allows to gauge the specific growth rate of P. pastoris using a RLS identification algorithm. Moreover, a methanol control system has been implemented for analyzing the effect of the substrate concentration in the productivity on a P. pastoris (phenotype Mut+) culture. And finally it has been analyzed the effect of mixed substrate strategy in Muts and Mut+ phenotypes of P. pastoris for the production of recombinant proteins.
Key words
Fed-batch, Pichia pastoris, mixed substrates, bioprocess, control, optimization, RLS.

Análisis cuantitativo y modelización del metabolismo de la levadura Pichia pastoris

Tue, 12 Apr 2011 14:47:12 GMT

Análisis cuantitativo y modelización del metabolismo de la levadura Pichia pastoris Santos de Jesus, Sérgio El presente trabajo está centrado en el análisis y modelización del metabolismo central de la levadura Pichia pastoris. Concretamente, el objetivo de este trabajo consistió en analizar la distribución de flujos en las principales vías metabólicas del metabolismo central de esta levadura mediante distintas aproximaciones experimentales y matemáticas basadas en un modelo metabólico estequiométrico y compartimentalizado. Los datos experimentales fueron obtenidos en su mayor parte del trabajo de tesis de A. Solà (Solà, 2004, tesis doctoral, Universitat Autònoma de Barcelona), centrado en experimentos de marcaje isotópico con 13C de cultivos de P. pastoris operados en quimiostato a μ=0,05 y 0,16 h-1 con diferentes fuentes de carbono (glucosa, glicerol, metanol y mezclas de glicerol/metanol). Los datos fisiológicos experimentalmente obtenidos en dicho estudio se han reconciliado a través de ecuaciones de balances elementales y por grado de reductancia; además, se ha propuesto una ecuación estequiométrica para la formación de biomasa para cada condición de cultivo estudiada. Los datos reconciliados a través de ecuaciones de balances elementales se han usado para el análisis de flujos metabólicos; en primer lugar, se ha utilizado la metodología clásica; los resultados obtenidos en esta primera aproximación se compararon con datos experimentales previamente obtenidos mediante técnicas de marcaje isotópico de 13C por A. Solà. El segundo estudio ha consistido en el cálculo de flujos metabólicos introduciendo restricciones derivadas de cocientes de flujos metabólicos estimados experimentalmente mediante técnicas de 13C-RMN. Dado el reducido número de restricciones derivadas de experimentos de 13C-RMN que se pueden aplicar en este modelo metabólico (3 o 4), en un tercer estudio se ha realizado una primera aproximación a metodologías de simulación y optimización del diseño de experimentos de marcaje isotópico con el objetivo de implementar un procedimiento experimental que permitiera obtener datos suficientes para determinar con más precisión los flujos a través de determinadas rutas de la red, particularmente los relacionados a la vía de las pentosas fosfato (PP). Concretamente, para explorar esta estrategia se han realizado estudios para la optimización de un experimento de marcaje para un cultivo operado en quimiostato utilizando glicerol como fuente de carbono a μ=0,05h-1; la estrategia de marcaje optimizada se llevó posteriormente a cabo en el laboratorio y se analizó los patrones de marcaje de los principales metabolitos (incluyendo algunos aminoácidos) y aminoácidos proteinogénicos mediante LC-MS/MS y 2D-RMN, respectivamente. Ello ha permitido comparar y combinar datos experimentales obtenidos mediante dos estrategias de análisis para la estimación de flujos metabólicos. Así, globalmente, este trabajo permite concluir que el análisis clásico de flujos metabólicos (MFA) es una herramienta de cálculo que está limitada a redes poco complejas; sin embargo cuando se aplican restricciones derivadas del análisis por 13C-RMN al MFA, se observa que esta metodología de análisis presenta alta sensibilidad para la determinación de distribución de flujos metabólicos en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA) y reacciones de transporte entre el citoplasma y la mitocondria. Por el contrario, utilizando una metodología de 13C-MFA basada en datos derivados de 13C-LC-MS, se observa que este método presenta poca sensibilidad en redes metabólicas compartimentalizadas, pues no permite distinguir los pools de metabolitos de un compartimiento dado (mitocondria/citoplasma). Sin embargo, este método presenta alta sensibilidad para la determinación de flujos a través de la vía de las PP. Así pues, la combinación de distintas metodologías basadas en datos de experimentos de marcaje isotópico ha permitido mejorar la información sobre el comportamiento del sistema. Finalmente, se ha llevado a cabo un análisis estructural de la red metabólica a través de la metodología del análisis de módulos elementales, así como una primera aproximación para su combinación con el análisis de flujos metabólicos basados en datos de marcaje isotópico con el objetivo de facilitar la interpretación fisiológica de los resultados, es decir, determinar cuales son las principales vías metabólicas activas bajo un estado fisiológico dado y cual es el flujo a través de dichas rutas.; This study is focused on the analysis and modelling of the central carbon metabolism of the yeast Pichia pastoris. In particular, the major aim of this study was to analyze de flux distribution through the main metabolic pathways of the central metabolism of this yeast by jeans of different experimental and mathematical approaches, based on a stoichiometric and compartmentalized metabolic model. Experimental data was mostly obtained from previous studies from A. Solà (Solà, 2004, PhD thesis, Universitat Autònoma de Barcelona), describing isotopic labelling experiments with 13C of P. pastoris cells growing on chemostat cultures at a growth rate of μ=0.05 and 0.16 h-1, on different carbon sources (glucose, glycerol, methanol and mixtures of glycerol/methanol). The experimental physiological data obtained in A. Solà's study have been reconciliated by means of elementary and grade of reductance balance equations; moreover, a stoichiometric equation for the formation of biomass has been proposed for each of the studied growth condition. The data reconciliated by elementary balance equations have been used for metabolic flux analysis.
First, the classic metabolic flux analysis methodology has been applied; the obtained results in this first approximation were compared with the experimental data previously generated from 13C-labeling experiments by A. Solà.
Second, metabolic fluxes have been calculated introducing a number of restrictions derived from metabolic flux ratios experimentally estimated by 13C-NMR.
Third, given the reduced number of restrictions derived from these experiments that are actually aplicable to the defined metabolic model (3 or 4), we performed a first approximation to methodologies for simulation and optimisation of isotopic labeling experiments; the aim of such approach was to implement an experimental procedure to allow for the generation of labelling data needed for the precise determination of fluxes through some pathways of the network, particularly those related to the pentose phosphate pathway (PPP). In order to explore this strategy, studies for the optimisation of a labelling experiment of cells growing on glycerol in chemostat cultures at a growth rate of 0.05 h-1 were performed. The optimised labelling strategy was subsequently implemented in the laboratory; the labelling patterns of the major metabolites (including some amino acids) of the central carbon metabolism and, of the proteinogenic amino acids, were analysed by LC-MS/MS and 2D-NMR, respectively. This allowed us comparing and combining experimental labelling data derived from two analytical strategies for the calculation of metabolic fluxes.
Overall, this study illustrates that classic metabolic flux análisis (MFA) is a mathematical tool limited to networks of low complexity. Nevertheless, when restrictions derived from 13C-NMR analyses are introduced MFA, this methodology shows a high sensitivity for the calculation of the metabolic flux distribution in the tricarboxylic acid cycle (TCA) and transport reactions of TCA intermediates between cytoplasm and mitochondria.
In contrast, by using a 13C-MFA methodology using data derived from 13C-LC-MS, we observe that this method shows low sensitivity for compartimentalized metabolic networks, as it did not allow distinguishing pools of a given metabolite found in different compartments (e.g. mitochondria/cytoplasm). Nevertheless, this method shows high sensitivity for determining fluxes through the PPP.
In summary, the combination of different methodologies based on the use of data obtained from isotopic labelling experiments has allowed us to improve the information on the system's behaviour. In addition, a structural analysis of the metabolic network has been performed using the methodology of elementary modes analysis; moreover, a first approximation to its combination with metabolic flux analysis based on 13C-derived data has been proposed, with the objective to facilitate the physiological interpretation of the results, i.e. to assess which are the major active pathways under a given physiological state and to calculate the carbon fluxes through these pathways.

Tractament de lleixius negres amb Trametes versicolor. Monitoratge del procés

Tue, 12 Apr 2011 14:47:12 GMT

Tractament de lleixius negres amb Trametes versicolor. Monitoratge del procés Font Segura, Xavier En aquest treball s'utilitza el fong Trametes versicolor, per al tractament de lleixius negres. Aquestes aigües residuals, procedents de la industria paperera son molt tòxiques i contenen una elevada càrrega orgànica, constituint un veritable problema ambiental per aquelles empreses que les produeixen
Després d'una introducció general sobre la producció del paper i la seva problemàtica ambiental, es continua amb la presentació dels resultats obtinguts. Aquests es presenten diferenciats en dos capítols:
- Inicialment es presenten les investigacions realitzades en el tractament del lleixius negres amb el fong Trametes versicolor. Aquests treballs es varen iniciar amb erlenmeyer, determinat-se les condicons de treball en quant a temperatura agitació i concentració de glucosa. Seguidament es passà a realitzar assaigs amb bioreactors. S'han utilitzat diferents tipus de bioreactors i de diferents volums. S'ha treballat des de tancs agitats de 300 ml, fins a un reactor tipus air-lift de 2 l. Els millors resultats, però, s'han obtingut amb reactors de tipus llit fluiditzat de 450 ml i reactors de llit fix de 450 ml. S'ha treballat amb el fong en forma de pellets i amb el fong immobilitzat en cubs de niló i d'escuma de poliuretà. A partir dels resultats obtinguts s'ha estudiat tant, la relació entre la producció enzimàtica i els paràmetres ambientals seguits com, la relació entre si dels diferents paràmetres ambientals.
- En un segon apartat es presenten els treballs duts a terme en el monitoratge del procés. En aquest sentit s'ha realitzat el muntatge d'un sistema d'adquisició de dades que inclou, mesura del pH i del pO2 i, mesures en línia, utilitzant la tècnica FIA (Flow Injection Analysis) del color, els compostos aromàtics i dels enzims lacasa i lignina peroxidasa. A més, en realitzar la validació del FIA de lignina peroxidasa amb lleixius negres, es va detectar un problema d'inhibició de l'enzim en presència de composts lignínics.
El treball finalitza amb l'Apèndix, on s'inclouen una bona part dels programes, muntatges i circuits electrònics realitzats, que han estat utilitzats en el monitoratge del procés.; En este trabajo se utiliza el hongo Trametes versicolor, para el tratamiento de lejías negras. Estas aguas residuales, procedentes de la industria papelera son muy tóxicas y contienen una elevada carga orgánica, constituyendo un verdadero problema ambiental en aquellas empresas que las producen.
Después de una introducción general sobre la producción del papel y su problemática ambiental, se continúa con la presentación de los resultados obtenidos. Estos se presentan diferenciados en dos capítulos:
- Inicialmente se presentan las investigaciones realizadas en el tratamiento del lejías negras con el hongo Trametes versicolor. Estos trabajos se iniciaron a escala erlenmeyer, determinándose las condiciones de trabajo en cuanto a temperatura agitación y concentración de glucosa. Seguidamente se pasó a realizar ensayos con biorreactores. Se han utilizado diferentes tipos de biorreactores y de diferentes volúmenes. Se ha trabajado con reactores de tanque agitado de 300 ml, así como con un reactor tipo air-lift de 2 l. Los mejores resultados, pero, se han obtenido con reactores de tipo lecho fluidizado de 450 ml y reactores de lecho fijo de 450 ml. Se ha trabajado con el hongo en forma de pellets y con el hongo inmovilizado en cubos de nylon y de espuma de poliuretano. A partir de los resultados obtenidos se ha estudiado tanto, la relación entre la producción enzimática y los parámetros ambientales seguidos como, la relación entre si de los diferentes parámetros ambientales.
- En un segundo apartado se presentan los trabajos llevados a cabo en la monitorización del proceso. En este sentido se ha realizado el montaje de un sistema de adquisición de datos que incluye, medida del pH y del pO2 y, medidas en línea, utilizando la técnica FÍA (Flow Injection Analysis) del color, los compuestos aromáticos y de las enzimas lacasa y lignina peroxidasa. Además, al realizar la validación del FÍA de lignina peroxidasa con lejías negras, se detectó un problema de inhibición de la enzima en presencia de compuestos lignínicos.
El trabajo finaliza con un Apéndice, dónde se incluyen una buena parte de los programas, montajes y circuitos electrónicos realizados, que han sido utilizados en la monitorización del proceso.; In this work the white-rot fungus Trametes versicolor is used for the treatment of black liquors. This type of wastewaters, coming from the pulp and paper industry, are very toxic and they content a high organic load, constituting a significant environmental problem for those companies that produce them.
A general introduction on the pulp and paper industry and its environmental problems is followed with the presentation of the obtained results. These results are shown in two main chapters:
- Initially the research carried out with Trametes versicolor applied to the treatment of black liquor is shown. These works started at Erlenmeyer level, to determine the work conditions with respect to agitation, temperature and glucose concentration. Next, assays in bioreactor were carried out. Different types of bioreactors (with different volumes) have been used. Work was performed with agitated tanks of 300 ml, and air-lift type reactor of 2 l. The best results, however, were obtained when 450 ml bed fluidized reactor was used. Assays were performed with the fungus in the form of pellets and with the fungus immobilized in cubes of nylon and polyurethane foam. From the obtained results, correlations between the enzymatic production and the environmental parameters, and the correlation among the different environmental parameters, have been studied.
- In a second chapter research carried out on process monitoring are presented. An automated system for on-line measurement of enzyme activity is proposed. The system uses a flow injection manifold in the stopped-flow mode to measure initial reaction rates. The time during which the flow is halted is selected in such a way as to optimise the enzyme/substrate ratio for the correct determination of activity values. The proposed system was used to determine the activity of laccase produced by the fungus Trametes versicolor immobilised on nylon in a fixed-bed reactor used for treating pulp mill waste water. Also a data acquisition system was developed for the monitoring of pH, pO2, color and aromatic compounds.

Study of the effect of process parameters on the thermophilic anaerobic digestion of sewage sludge, evaluation of a thermal sludge pre-treatment and overall energetic assessment

Tue, 12 Apr 2011 14:47:12 GMT

Study of the effect of process parameters on the thermophilic anaerobic digestion of sewage sludge, evaluation of a thermal sludge pre-treatment and overall energetic assessment Ferrer i Martí, Ivet El consum energètic representa un 30 % dels costos d'operació en sistemes intensius de tractament d'aigües residuals urbanes. En depuradores convencionals que utilitzin un sistema de fangs activats, entorn al 15-20 % de l'energia és consumida en la línia dels fangs, que inclou el bombeig, l'espessiment, l'estabilització i la deshidratació. Per tant, la optimització de la gestió dels fangs pot contribuir substancialment en la reducció dels costos de tractament d'aigües residuals. La digestió anaeròbia termofílica és més eficient que la mesofílica i pscicrofílica, en termes de producció de biogàs i metà, eliminació de sòlids volàtils (SV) i destrucció de patògens. El procés es pot accelerar mitjançant el pre¬tractament dels fangs, afavorint la seva solubilització i hidròlisi.
L'objecte d'aquesta Tesi Doctoral fou estudiar l'impacte dels paràmetres del procés en la digestió anaeròbia termofílica dels fangs de depuradora urbana, avaluar l'efecte del pre-tractament tèrmic dels fangs a baixa temperatura, i valorar processos alternatius des del punt de vista energètic.
Els resultats experimentals presentats s'obtingueren mitjançant l'operació de dos reactors de laboratori durant prop de dos anys. En aquest període es va estudiar l'efecte de la temperatura del procés, del temps de retenció dels fangs (TRF), de la velocitat de càrrega orgànica (VCO) i del pre-tractament a 70 ºC en la digestió anaeròbia dels fangs de depuradora. El procés fou avaluat en termes de la producció d'energia (biogàs i metà) i de la qualitat del fang digerit (contingut de SV i d'àcids grassos volàtils (AGV), facilitat de deshidratació i higienització). S'analitzà l'estabilitat del procés a mesura que es reduïa el TRF i s'incrementava la VCO, i es comparà l'eficiència en períodes d'estabilitat corresponents a les diferents condicions operacionals. Finalment, s'avaluaren els resultats des del punt de vista energètic, mitjançant el càlcul de balanços i ratis energètics teòrics, que es compararen amb els resultats obtinguts a partir de dades experimentals d'altres estudis. També s'utilitzà un model cinètic de primer ordre. Les conclusions que es desprenen d'aquest treball es resumeixen a continuació:
Durant la digestió anaeròbia dels fangs, la transició d'un reactor mesophilic (43 ºC) a termofílic (50 ºC) es podria dur a terme sense alterar el procés, treballant a TRF elevats (≥ 30 dies) i VCO baixes (≤ 0.5 kg SV m-3reactor d-1). En aquestes condicions, les principals diferències entre reactors termofílics (50-55 ºC) i mesofílics (38-43 ºC) fan referència a una certa acumulació d'AGV (0.5-2.5 g L-1) i millora de la destrucció de patògens (E. coli ≤ 102 UFC mL-1). La digestió termofílica a 50 ºC i 55 ºC dóna lloc a resultats similars pel que fa a la producció de biogàs, estabilització, higienització i facilitat de deshidratació de l'efluent, si no varien els altres paràmetres operacionals.
La producció de metà tendeix a incrementar proporcionalment a la VCO, és a dir al TRF i el contingut de SV als fangs alimentats. Així mateix, la qualitat de l'efluent (contingut de SV i AGV, facilitat de deshidratació dels fangs) també depèn de la VCO. D'acord amb els resultats obtinguts a 55 ºC, la producció de metà s'incrementà 2-3 vegades (de 0.2 a 0.4-0.6 m3CH4 m3reactor d-1) en disminuir el TRF de 30 a 15-10 dies, incrementant la VCO de 0.5 a 2.5-3.5 kg SV m3reactor d-1. En canvi, el procés es desestabilitzà amb la reducció del TRF a 6 dies i VCO per sobre de 5 kg SV m3reactor d-1. Les següents concentracions poden ser útils per detectar i prevenir la desestabilització d'un digestor termofílic de fangs: AGV totals
(2.5 g L-1), acetat (0.5 g L-1), rati acetat/propionat (0.5), alcalinitat intermèdia (1.8 g CaCO3 L-1), rati alcalinitat intermèdia/alcalinitat parcial (0.9), rati alcalinitat intermèdia/alcalinitat total (0.5), contingut de metà al biogàs (55 %).
El pre-tractament a 70 ºC afavoreix la solubilització dels fangs, incrementant la proporció de matèria orgànica soluble respecte la matèria orgànica total del 5 % al 50 % en 9-24 h; seguit d'una progressiva generació d'AGV després de 24h. Durant la subseqüent digestió anaeròbia de fangs pre¬tractats (9-48 h), s'incremetà la producció de biogàs en un 30-40 %, treballant a 55 ºC i 10 dies de TRF. El rendiment de producció de biogàs fou un 30 % superior amb fangs pre-tractats (0.28-0.30 vs. 0.22 L·gVS¬1) i el contingut de metà al biogàs també fou superior (69 % vs. 64 %).
La digestió anaeròbia termofílica de fangs pot donar lloc a una producció neta d'energia, durant estacions fredes i càlides, si s'utilitzen reactors amb aïllament tèrmic de les parets i amb recuperació energètica a partir del biogàs i dels fangs digerits. En aquest cas, l'eficiència energètica de reactors termofílics treballant a la meitat de TRF (10-15 dies) que reactors mesofílics (20-30 dies) seria similar, per la qual cosa el cabal diari podria ser doblat, o el volum del reactor reduït, amb el conseqüent estalvi en el cost de tractament dels fangs. A més, un sistema en dues etapes (70/55 ºC) produiria més energia neta que un sistema en una sola etapa (55 ºC) amb un TRF de 10 dies. De totes maneres, la quantitat d'energia neta generada augmenta amb el volum del digestor donat que, malgrat la disminució en la producció de metà a TRF creixents, la producció d'energia segueix essent superior al consum, i per tant com més quantitat de fangs hi hagi al digestor, més energia es produirà.; Energy consumption accounts for some 30 % of the total operating costs of intensive sewage treatment systems. In conventional wastewater treatment plants employing an activated sludge process, around 15-20 % of this energy is used in the sludge treatment line, including sludge pumping, thickening, stabilisation and dewatering. Therefore, optimisation of sludge management can substantially contribute in the reduction of wastewater treatment costs. Thermophilic anaerobic digestion is more efficient than mesophilic anaerobic digestion, in terms of biogas production, volatile solids (VS) removal and pathogens destruction. The process might be further accelerated by sludge pre-treatment, promoting sludge solubilization and hydrolysis.
The aim of this PhD Thesis was to study the impact of process parameters on the thermophilic anaerobic digestion of sewage sludge, to evaluate the effect of implementing a low temperature pre¬treatment step, and to assess alternative processes from an energy perspective.
The experimental results presented were obtained by operating two lab-scale reactors for almost two years. During this period, the effect of process temperature, sludge retention time (SRT), organic loading rate (OLR) and 70 ºC sludge pre-treatment on the anaerobic digestion of sewage sludge was studied. The process was evaluated in terms of energy production (i.e. biogas and methane production) and the quality of the effluent sludge (i.e. VS and volatile fatty acids (VFA) content, sludge dewaterability and hygienisation). Focus was put on the stability of the process at decreasing SRT and increasing OLR. Process efficiency during stable performance under each operating condition assayed was compared. Finally, the results were assessed from an energy perspective, by means of theoretical energy balances and ratios; and compared to the results obtained with experimental data from other studies. A first order kinetic model was also used. The conclusions drawn from the different issues dealt in this work are summarised as follows:
During anaerobic sludge digestion, the transition from a mesophilic (43 ºC) to a thermophilic operation (50 ºC) may be carried out without disturbing the process, by operating the reactors at high SRT ( ≥ 30 days) and low OLR (≤ 0.5 kg VS m-3reactor d-1). Under such conditions, some VFA accumulation (0.5-2.5 g L-1) and enhanced pathogen destruction (residual E. coli ≤ 102 CFU mL-1) would be the main differences of thermophilic (50-55 ºC) compared to mesophilic (38-43 ºC) reactors. Thermophilic sludge digestion at 50 ºC and 55 ºC should be similar in terms of biogas production and effluent stabilisation, hygienisation and dewaterability; provided that other process parameters are the same.
Methane production rate tends to increase proportionally to the OLR, thus to the SRT and VS concentration in the feed sludge. Similarly, the quality of the effluent sludge (VS content, VFA content and sludge dewaterability) is also affected by the OLR. According to the results obtained at 55 ºC, methane production rate increased by 2-3 times (from 0.2 to 0.4-0.6 m3CH4 m3reactor d-1) by decreasing the SRT from 30 to 15-10 days; increasing the OLR from 0.5 to 2.5-3.5 kg VS m3reactor d-1. However, process unbalance resulted from SRT reduction to 6 days, with OLR above 5 kg VS m3reactor d-1. The following concentrations might be useful to detect and prevent digester failure during thermophilic sludge digestion: total VFA (2.5 g L-1), acetate (0.5 g L-1), acetate/propionate ratio (0.5), intermediate alkalinity (1.8 g CaCO3 L-1), intermediate alkalinity/partial alkalinity ratio (0.9), intermediate alkalinity/total alkalinity ratio (0.5), methane content in biogas (55 %).
The 70 ºC sludge pre-treatment may initially promote sludge solubilization, increasing the concentration of soluble to total organic matter from 5 to 50 % within 9-24 h; which is followed by a progressive VFA generation after 24 h. Subsequent anaerobic digestion of pre-treated sludge samples (9¬48 h) could increase biogas production by 30-40 % working at 55 ºC with a SRT of 10 days. Biogas yield is some 30 % higher with pre-treated sludge (0.28-0.30 vs. 0.22 L·gVSfed-1) and methane content in biogas is also higher with pre-treated sludge (69 vs. 64 %).
Thermophilic anaerobic sludge digestion would result in net energy production, during cold and warm seasons, provided that digesters with wall insulation and with energy recovery from both the biogas produced and the effluent sludge are used. In this case, the energetic efficiency would be similar for thermophilic digesters working at half the SRT (10-15 days) of mesophilic digesters (20-30 days), meaning that the sludge daily flow rate could be doubled, or the reactor volume reduced, with subsequent savings in terms of sludge treatment costs. Furthermore, two-stage systems (70/55 ºC) may result in higher net energy production compared to single-stage systems (55 ºC) at 10 days SRT. However, the amount of surplus energy generated increases with digester volume. In spite of the decrease in methane production rate at increasing SRT, energy production is still higher than energy consumption, and therefore the bigger the amount of sludge in the digester, the higher the energy production.

Cèl·lules mare mesenquimals humanes: aïllament, caracterització i potencialitat per a la regeneració cardíaca

Tue, 12 Apr 2011 14:47:11 GMT

Cèl·lules mare mesenquimals humanes: aïllament, caracterització i potencialitat per a la regeneració cardíaca Farré Crespo, Jordi La insuficiència cardíaca congestiva és una epidèmia creixent a nivell mundial. Les causes principals de la insuficiència cardíaca estan relacionades amb el dany irreversible que resulta d'un infart de miocardi. El cor humà té una capacitat de regeneració limitada, i la pèrdua de múscul, juntament amb la contracció i la fibrosi de la cicatriu miocàrdica, posen en joc un conjunt d'esdeveniments anomenats remodelat ventricular, que finalment tendeixen cap a una insuficiència cardíaca congestiva.
En l'actualitat no hi ha cap tractament o procediment clínic, amb excepció del trasplantament cardíac, que substitueixi la cicatriu de l'infart per teixit contràctil funcional. Recentment, la identificació de diferents tipus de cèl·lules mare capaces de contribuir a la regeneració dels teixits ha generat un notable interès en la possibilitat que la teràpia cel·lular pugui ser utilitzada per reparar el miocardi danyat (cardiomioplàstia cel·lular). No obstant això, es desconeix encara quin és el tipus cel·lular ideal per a la cardiomioplàstia cel·lular.
Tradicionalment, es pensava que les cèl·lules mare pròpies d'un teixit adult només podien diferenciar-se cap a cèl·lules del teixit d'origen. Recentment, però, un conjunt d'estudis han demostrat que les cèl·lules mare adultes poden diferenciar-se cap a llinatges diferents als del seu teixit d'origen exhibint una plasticitat que ha estat anomenada transdiferenciació. Les cèl·lules mare mesenquimals són unes cèl·lules no hematopoètiques que típicament s'han aïllat del moll d'os però que més endavant s'ha demostrat que resideixen virtualment en tots els teixits. La seva accessibilitat, capacitat proliferativa, potencial de diferenciació i perfil immunològic fan que les cèl·lules mare mesenquimals adultes siguin un candidat principal per l'aplicació en teràpia regenerativa.
En aquesta tesi hem aïllat i estudiat tres tipus de cèl·lules mare d'origen mesenquimal de tres teixits diferents, el moll d'os, el teixit adipós subcutani i el teixit adipós epicàrdic. Tots ells s'han caracteritzat in vitro i se n'ha estudiat la velocitat de creixement, la seva expressió de marcadors de superfície i la seva capacitat pluripotencial vers els llinatges adipogènic i osteogènic. La recerca en aquesta tesi però, s'ha centrat en el seu potencial per a la regeneració cardiovascular. Per aquest motiu es va estudiar el potencial cardiomiogènic mitjançant l'anàlisi de l'expressió basal de marcadors característicament cardíacs i la seva capacitat de diferenciació cap a cardiòcits. Dels resultats obtinguts en aquesta primera fase in vitro vam concloure que les cèl·lules progenitores derivades de greix epicàrdic (epiATPC), unes cèl·lules no descrites fins ara, eren el candidat cel·lular ideal per a l'estudi del seu potencial de regeneració del miocardi infartat in vivo. Per aquest motiu, es va estudiar l'efecte de les epiATPC trasplantades en dos models animals d'infart de miocardi en els quals es va observar una notable millora del miocardi infartat a nivell histològic i de funció.
En conclusió, les epiATPC són una font cel·lular alternativa per a la cardiomioplàstia cel·lular, com ho demostra la seva capacitat de diferenciació cap a cardiòcit i cèl·lula endotelial, així com la millora de la funció cardíaca observada en els dos models d'infart agut de miocardi estudiats en aquest treball.; Congestive heart failure is a growing epidemic worldwide. The main causes of heart failure are related to the irreversible damage that results from a heart attack. The human heart has a limited capacity for regeneration, and loss of muscle, along with contraction and fibrosis of the myocardial scar, put into play a series of events known as ventricular remodelling, which ultimately tend to congestive heart failure.
At present there is no treatment or clinical procedure, with the exception of heart transplant, to replace the scar tissue for a viable tissue with contractile function. Recently, the identification of different types of stem cells capable of contributing to the regeneration of tissues has generated a significant interest in the possibility that cell therapy can be used to repair the damaged myocardium (cellular cardiomyoplasty). However, it is not known yet which cell type is ideal for the cellular cardiomyoplasty.
Traditionally, it was thought that stem cells of an adult tissue could only differentiate itself into cells types of the tissue of origin. Recently, however, a number of studies have shown that adult stem cells can differentiate itself into different lineages of their tissue of origin displaying a plasticity that has been called transdifferentiation. Adult mesenchymal stem cells are a non-haematopoietic cells that typically have been isolated from the bone marrow but was later shown to reside in virtually all tissues. Its accessibility, proliferative capacity, potential for differentiation and immunological profile makes adult mesenchymal stem cells a primary candidate for the application in regenerative therapy.
In this thesis we isolated and studied three types of stem cells of mesenchymal origin from three different tissues, bone marrow, subcutaneous fat and epicardic adipose tissue. All of them have been characterized in vitro and has studied the rate of growth, their expression of surface markers and their capacity towards the adipogenic and osteogenic lineages. Research in this thesis however, has focused on the potential for cardiovascular regeneration. That is why we studied the cardiomyogenic potential by analyzing the expression of basal characteristically cardiac markers and their ability to differentiate into cardiomyocytes. Based on the results obtained in this first phase in vitro we conclude that epicardial fat progenitor cells (epiATPC), a stem cell type not reported until now, were the ideal cell type for the study of their potential to regenerate myocardial infarction in vivo. For this reason, we studied the effect of epiATPC transplanted in two animal models of myocardial infarction in which there was a remarkable improvement of the infracted myocardium at histological and functional levels.
In conclusion, epiATPC are an alternative cell source to cellular cardiomyoplasty, as demonstrated by their ability to differentiate into cardiomyocytes and endothelial cells, as well as the improvement of cardiac function observed in the two models of acute myocardial infarction studied in this work.