Técnicas moleculares para la caracterización microbiológica de los procesos de eliminación de nutrientes en las EDARs = Molecular techniques for microbiological characterization of nutrient removal processes at WWTPs

Abstract

La presente tesis titulada Técnicas moleculares para la caracterización microbiológica de los procesos de eliminación de nutrientes en las EDARs, se ha desarrollado desde dos puntos de vista, el primero fue la puesta a punto de diferentes técnicas moleculares para la caracterización de las comunidades microbianas, especialmente las comunidades responsables de eliminación de nutrientes, presentes en las EDARs. El segundo fue la aplicación de las técnicas, desarrolladas en el primer punto, para cuantificar y caracterizar las distintas comunidades microbianas y su relación con el funcionamiento de los procesos de depuración de las aguas residuales. Los dos bloques mencionados arriba se llevaron a cabo en tres capítulos que forman la columna vertebral de la tesis. En el primer capítulo de la tesis se desarrollaron y aplicaron las técnicas de citometría de flujo y microscopía de epifluorescencia para la cuantificación numérica y de viabilidad de las células procariotas presentes en los reactores biológicos de dos EDARs que funcionan con proceso de fangos activos con aireación prolongada. Durante varios meses muestras de fangos activos han sido analizadas a escala de laboratorio aplicando las técnicas de citometría y microscopía de epifluorescencia combinadas con fluorocromos de marcaje molecular de los ácidos nucleicos. La realización fiable de los análisis con ambas técnicas solo ha sido posible tras un tratamiento previo de las muestras mediante un protocolo de desagregación de los flóculos de fangos presentes en las muestras. Los resultados se compararon entre ambas técnicas, los resultados no revelaron diferencias significativas entre sí. Sin embargo la técnica de citometría mostró ser la mejor opción debido a la sencillez y rapidez de los análisis. Por otra parte la caracterización de las EDARs estudiadas mostró una gran estabilidad del proceso de fangos activos con aireación prolongada, una de las características más destacadas del sistema que le otorga la gran aplicabilidad que tiene dentro de los procesos de fangos activos y sus variantes. En el segundo capítulo se aplicó la técnica de hibridación In situ fluorescente junto con la técnica de DAPI para cuantificar y caracterizar las comunidades nitrificantes y bacterias totales, respectivamente, en una planta piloto de nitrificación parcial con sistema de lechos móviles (carriers). Ambas técnicas mostraron su gran utilidad en base a los resultados obtenidos que fueron en acuerdo con el funcionamiento observado en la planta piloto. En este capítulo se logró obtener un sistema de nitrificación parcial en base a los parámetros operacionales sobre todo mediante el control de la temperatura del sistema y el tiempo de retención hidráulico. Por último, en el capítulo tres, se ha investigado un nuevo enfoque de diseño de estándares para la técnica de qPCR para la cuantificación y caracterización de las comunidades microbianas presentes en tres EDARs con procesos operacionales biológicos distintos. La técnica de diseño de estándares aplicada fue la técnica de Double-stranded gBlocks Gene Fragments. Los microorganismos estudiados fueron las bacterias totales, bacterias nitrificantes, arqueas, microorganismos acumuladores de polifosfato. Estos últimos fueron estudiados mediante la técnica de FISH por falta de sondas fluorogénicas específicas para su cuantificación mediante qPCR. Los resultados obtenidos mostraron la gran utilidad de la técnica de gBlocks como método fácil, rápido y asequible para el diseño de estándares. Todos los estándares estudiados fueron mejorados. El estudio de las EDARs tanto a nivel microbiológico como operacional reveló ciertas correlaciones significativas entre ambas partes, mientras otras no fueron muy concluyentes debido a varios factores como pueden ser limitaciones del método de extracción de ADN, el nivel especificad de algunas sondas de ADN. Todas estas hipótesis se han de estudiar más adelante con el objetivo de entender mejorar algunas estas correlaciones.