Caracterización cuantitativa de las ciclinas de la fase G1 del ciclo celular en Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Saccharomyces cerevisiae és un microorganisme unicel·lular eucariota que per presentar el seu genoma totalment seqüenciat, gran facilitat de manipulació en el treball de laboratori, ja que molts dels seus gens es troben conservats en organismes superiors com l'humà (Dujon, 1996, Goffeau et al., 1996 ; Harashima et al. 2013), es presta com un model ideal per a l'estudi, en aquest cas, de la progressió del cicle cel·lular. El cicle cel·lular de S. cerevisiae es troba regit per dos CDK s: la primera, Cdc28, és considerada essencial, mentre que la segona, Pho85, es considerada una CDK redundant. Les dues CDK s són activades per la unió a les seves diferents ciclines, i aquestes són expressades periòdicament, actuant en punts concrets del cicle cel·lular, a excepció de CLN3 que es troba al llarg de tot el cicle (Lodish et et al. 2000; Bouchoux & Uhlmann , 2011). Els estudis realitzats fins al moment sobre l'estudi del comportament de les ciclines al llarg del cicle s'han centrat únicament en Cdc28, deixant un buit sobre com es comporten les ciclines de Pho85. A més, aquests estudis s'han realitzat a nivell qualitatiu, de manera que es desconeix la importància de cada ciclina individualment, ja que no permeten la comparació d'una respecte a l’altra. Els experiments realitzats en aquesta tesi han permès obtenir informació quantitativa, gràcies a una metodologia de treball que ha permès etiquetar totes les ciclines de G1 de la mateixa manera i s'han pogut analitzar totes elles alhora mitjançant western blot, permetent la seva quantificació i comparació de totes amb totes, tant en condicions normals de laboratori com en condicions de diferents tipus d'estrès. A més, durant la posada a punt de la metodologia de marcatge de les ciclines, es va obtenir de forma inesperada un primer resultat, que indicava que l'alteració de la regió 3'UTR afectava d'alguna manera, a l'expressió gènica. Pel que es va decidir seguir una estratègia de marcatge que respectés completament al 3'UTR. D'altra banda, els resultats obtinguts han demostrat que en condicions normals de laboratori, la proporció de Pcl's i Cln’s és la mateixa. Així mateix, en condicions d'estrès tèrmic, la quantitat de Pcl’s es troba molt per sobre de la de Cln’s. I més encara, en aquestes condicions d'estrès tèrmic, la deleció de Pcl2 provoca un retard en la progressió del cicle cel·lular en un fons BY4741 i la inviabilitat en un fons W303-1a. Aquests resultats posen de manifest que els complexos Pho85-Pcl presenten una funció específica, en aquest cas davant de l'adaptació a estrès tèrmic, i no solament una funció redundant com se li atribuïa fins al moment. Els resultats obtinguts en aquesta tesi deixen la porta oberta a futures investigacions sobre com Pcl2 actua sota estrès tèrmic, quins mecanismes de síntesi i degradació el regulen i quines aplicacions podria tenir la seva manipulació en organismes patògens com C. albicans per inhibir la seva patogenicitat, organisme que creix preferentment a 37⁰C, i en el qual s'ha observat que la presència de Pcl2 evita el creixement filamentós característic de la seva virulència (Gow et al. 2002).