La simulación del ambiente oviductal modula la capacitación espermática y la fertilidad in vitro en la especie porcina

Abstract

La fecundación es un proceso biológico complejo en el que innumerables factores están directa o indirectamente implicados. Aunque la eficiencia de la fecundación in vitro (IVF) es, en animales sanos, menor que in vivo, en algunas especies de mamíferos como la bovina o la murina se ha alcanzado un alto rendimiento, sin embargo en la especie porcina el rendimiento de la IVF es aún subóptimo. Actualmente, la penetración polispérmica de los ovocitos permanece como uno de los principales obstáculos en la IVF porcina y la simulación de las condiciones in vivo de capacitación espermática y fecundación se postula como la mejor estrategia para mejorar los resultados de IVF. La concentración de bicarbonato (HCO3-), uno de los efectores de la capacitación espermática a través de la activación de la vía de la adenilato ciclasa soluble (sAC)/AMP cíclico (cAMP)/proteína kinasa A (PKA), varía enormemente en los diferentes ambientes que los espermatozoides maduros atraviesan desde la cola del epidídimo (~3-4 mM) al oviducto (de 10 mM en el istmo hasta entre 25 y 90 mM en el lugar de fecundación, dependiendo de la fase del ciclo estral). En el oviducto, la baja concentración de HCO3- en la porción caudal del istmo permite a los espermatozoides permanecer unidos a las células del epitelio oviductal en un estado quiescente y formando el reservorio espermático (SR). Durante la ovulación, acontece un incremento de la concentración de HCO3- que desencadena la hiperactivación del espermatozoide y permite su liberación desde el SR. La secreción de HCO3- provoca un gran incremento del pH en la fase periovulatoria desde aproximadamente 6,5 en el istmo a incluso 8,0 en la ampolla oviductal. El flujo creciente de HCO3- y pH permite el transporte del espermatozoide al lugar de fecundación en la unión ampular-ístmica (AIJ), el desarrollo de la reacción acrosómica (AR) para atravesar las envolturas del ovocito y la penetración. El ambiente oviductal periovulatorio en el que estos fenómenos tienen lugar es bastante diferente de las características in vitro de los medios habitualmente utilizados para la capacitación espermática y IVF, que contienen una concentración de HCO3- estándar de 25 mM y un pH de 7,4. Estos procesos biológicos in vivo tienen lugar en fluidos específicos del tracto genital de la hembra, los fluidos uterino (UF) y oviductal (OF). Sin embargo, la capacitación in vitro y la IVF se producen actualmente en sistemas estáticos en medios químicamente definidos, con diversos grados de complejidad pero con composición y características físicas limitadas (probablemente distantes de las que se encuentran en las secreciones reproductivas), y en tubos o placas de plástico en las que los gametos contactan aleatoriamente, más que por selección y/o competición espermática. Y ninguno de ellos ha sido extendido ampliamente en los laboratorios de reproducción ni han conseguido eliminar el problema de la polispermia. Este trabajo se centra en el efecto que sobre el rendimiento de la IVF tienen factores como la concentración de HCO3- y el pH del medio (pH extracelular, pHe), las secreciones oviductales periovulatorias y un dispositivo en el que los gametos se disponen físicamente separados y los espermatozoides han de nadar para contactar con los ovocitos. En el Capítulo 1, se estudió el efecto de diferentes concentraciones de HCO3- (0, 5, 15 and 25 mM) en la capacitación de espermatozoides maduros y se evaluaron diferentes parámetros de funcionalidad espermática, incluida la fertilidad in vitro. El pHi se incrementó tras la absorción de HCO3-, pero solo concentraciones extracelulares de 15 mM o superiores activaron la cascada de capacitación de cAMP/PKA en el espermatozoide. El tiempo requerido para producir una alta fosforilación de los sustratos de PKA (PKAs-P) fue dependiente de la concentración de HCO3-, dado que con 15 mM fue más tardía que con la concentración habitual de 25 mM. 15 mM de HCO3- también estimuló una motilidad lineal en los espermatozoides y la fosforilación de tirosina (Tyr-P). Para evaluar la capacidad fecundante de los espermatozoides dependiendo de la concentración de HCO3- del medio, se analizaron dos sistemas: i) un sistema de IVF en una fase (IVF monofásica) en la que los espermatozoides se inseminaron directamente sin ningún tratamiento previo y co-cultivados con los ovocitos en un medio de IVF con las diferentes concentraciones de HCO3-, y ii) un sistema de IVF en dos fases (IVF bifásica) en la que los espermatozoides primero se incubaron durante 60 min en un medio capacitante con diferentes concentraciones de HCO3- y después inseminados en un medio de IVF con los ovocitos y la misma concentración de HCO3- que en la preincubación o superior. Los resultados de la IVF monofásica mostraron que 15 mM produjo una eficiencia más alta (26,2%). En la IVF bifásica, la preincubación y IVF a 15 mM alcanzó un 33,9% de zigotos viables (ovocitos penetrados por solo un espermatozoide), lo que resultó en un incremento significativo del 25,3%. El Capítulo 2 combinó un medio con el pH del oviducto durante la fase periovulatoria (pHe 8,0), una mezcla de componentes oviductales periovulatorios formada por secreciones de los COCs, FF y FO periovulatorio (OFCM) y un dispositivo que interpone una barrera física entre los gametos (un tapón de rosca de tubo Falcon® invertido, S) en el que los espermatozoides han de nadar al encuentro con los ovocitos. Los resultados mostraron que el uso combinado de los tres factores estudiados (pHe 8,0, adición de OFCM y el dispositivo S) redujo la polispermia e incrementó la eficiencia final de obtención de zigotos viables a un 48,7% comparado con el sistema clásico a pHe 7,4, carente de OFCM y con el dispositivo W (18,9%). El estudio de la funcionalidad espermática en las condiciones de IVF descritas mostró que tanto pHe como OFCM modulan la capacitación espermática. Los parámetros de motilidad y el estatus de capacitación a través de Tyr-P fue menor a pHe 8,0 y con OFCM. PKAs-P y AR fueron menores en presencia de OFCM, independientemente del pHe. Pudimos concluir que la mayor eficiencia en la IVF con pHe 8,0, presencia de OFCM y el dispositivo S podría ser una consecuencia directa de la acción de los componentes de OFCM sobre los gametos. Los resultados obtenidos en este trabajo sugieren que las actuales condiciones subóptimas de la IVF en la especie porcina pueden ser mejoradas simulando el ambiente oviductal periovulatorio in vivo. Ajustando la concentración de HCO3- y el equilibrio ácido-base de los sistemas de IVF porcina, añadiendo fluidos oviductales periovulatorios y utilizando un dispositivo en el que los gametos son ubicados físicamente separados pero con posibilidad de contactar, incrementa la eficiencia de la IVF, reduce la polispermia y se obtiene una alta proporción de zigotos potencialmente viables. A pesar de los innumerables factores, conocidos y no conocidos, que influyen en los procesos de capacitación y fecundación, con este trabajo se muestran nuevas vías hacia la mejora de la IVF en la especie porcina y, probablemente, un nuevo modelo de ART para todas las especies.

Fertilization is a complex biological process in which innumerable factors are directly and/or indirectly involved. Although the efficiency of in vitro fertilization (IVF) is, for healthy animals, lower than in vivo, in some mammalian species such as bovine or murine a high yield has been achieved. However, in porcine species the IVF is still suboptimal. Currently, the polyspermic penetration of oocytes remains the main obstacle in porcine IVF, and the in vitro simulation of in vivo conditions of sperm capacitation and fertilization is postulated as the best strategy to improve the IVF output. The concentration of bicarbonate (HCO3-), one of the spermatozoa capacitating effectors which acts through activating the soluble adenylyl cyclase (sAC)/cyclic AMP (cAMP)/protein kinase A (PKA) pathway, varies greatly in the different environments that mature spermatozoa go through from the cauda epididymis (~3-4 mM) to the oviduct (from 10 mM in the isthmus to between 25 and 90 mM in the fertilization site, depending on the stage of the estrous cycle). In the oviduct, the low HCO3- concentration in the caudal portion of the isthmus allows the spermatozoa to remain in a quiescent state, attached to the oviductal epithelial cells and forming the sperm reservoir (SR). At ovulation, there is an increase in HCO3- concentration, which triggers the hyperactivation of spermatozoa that allows their release from the SR. The HCO3- secretion provokes a great increase in pH in the periovulatory phase from around 6.5 in the isthmus and to around 8.0 in the oviductal ampulla. The increasing flow of HCO3- and pH enable the spermatozoa transport to the fertilization site at the ampullary-isthmic junction (AIJ), the development of the acrosome reaction (AR) to penetrate the egg vestments and oocyte fertilization. The periovulatory oviductal environment in which these phenomena take place is quite different from the in vitro characteristics of the medium usually used for sperm capacitation and IVF which contains a standard concentration of HCO3- of 25 mM and pH 7.4. These biological processes in vivo take place in specific fluids of the female genital tract, the uterine fluid (UF) and oviductal fluid (OF). However, in vitro sperm capacitation and IVF are presently produced in static systems in chemically defined media, with diverse grades of complexity but of limited composition and physical characteristics (probably distant from those encountered in the reproductive secretions), and plastic tubes or dishes in which gametes make contact randomly, rather than by selection and/or sperm competition. And none has been widely used in reproduction laboratories or eliminated the great problem of polyspermy in pigs. This work focuses on the effect on IVF of factors such as HCO3- concentration and pH of the medium (extracellular pH, pHe), the effect of periovulatory oviductal secretions and a device in which gametes are located physically separated and spermatozoa must swim to contact the oocytes. In chapter 1, the effects of different HCO3- concentrations (0, 5, 15 and 25 mM) were studied on the capacitation of mature spermatozoa and different functionality parameters were determined, including in vitro fertility. The pHi increased in spermatozoa after HCO3- uptake but only extracellular concentrations of 15 mM and above activated the cAMP/PKA capacitation cascade in the spermatozoa. The time required for the high phosphorylation of PKA substrates (PKAs-P) was HCO3- concentration-dependent, since at 15 mM it took PKAs-P significantly longer than with the usual concentration of 25 mM. 15 mM of HCO3- also stimulated sperm linear motility and tyrosine phosphorylation (Tyr-P). To evaluate spermatozoa fertility according to the HCO3- concentration of the medium, two different IVF systems were contemplated: i) a one-phase IVF system (monophasic IVF), in which spermatozoa were directly inseminated without any previous treatment and co-cultured with the oocytes in an IVF medium with the different HCO3- concentrations, and ii) a two-phases IVF system (biphasic IVF) in which spermatozoa were first pre-incubated for 60 min in a capacitating medium with different HCO3- concentrations and then inseminated in an IVF medium with the oocytes that contained the same or higher HCO3- concentration than in pre-incubation. The results of monophasic IVF showed that 15 mM led to higher efficiency (26.2%) than the rest of concentrations. In the biphasic IVF, both pre-incubation and IVF at 15 mM achieved 33.9% of viable zygotes (oocytes penetrated by only one spermatozoa), which represented in a significant increase of 25.3%. Chapter 2 combined a medium with the pH found in the oviduct during the periovulatory stage (pHe 8.0), a mixture of oviductal periovulatory components formed by COC secretions, follicular fluid and oviductal periovulatory fluid (OFCM) and a device that interposes a physical barrier between gametes (an inverted screw cap of a Falcon® tube, S) in which spermatozoa must to swim towards the encounter with the oocytes. The results showed that the combined use of the three factors studied (pHe 8.0, OFCM addition and S device) reduced polyspermy and increased the final efficiency of viable zygotes obtained to 48.7% compared with the classical system at pHe 7.4, lacking OFCM and a W device (18.9%). The spermatozoa functionality study under these IVF conditions showed that both pHe and OFCM modulate sperm capacitation. The motility parameters and capacitation status through Tyr-P was lower at pHe 8.0 and with OFCM. PKAs-P and AR were lower in the presence of OFCM, independently of the pHe. We concluded that the higher efficiency of IVF with pHe 8.0, in the presence of OFCM and using an S device could be a direct consequence of the action of OFCM components on gametes. The results obtained in this work suggest that the current suboptimal IVF conditions in porcine species can be improved by simulating the in vivo periovulatory milieu in the oviduct. Adjusting the HCO3- concentration and acid-base equilibrium of the porcine IVF systems, adding periovulatory oviductal fluids and using a device in which gametes are located physically separated but with a means of contact, increased the efficiency of IVF by reducing polyspermy and obtaining higher proportion of potentially viable zygotes. Despite the innumerable known and unknown factors that influence the capacitation and fertilization processes we identify new paths towards improving IVF in porcine and probably a new model for ARTs in all species