Electrochemical tunneling microscopy and spectroscopy of electron transfer proteins

Abstract

Electron Transfer (ET) plays essential roles in crucial biological processes such as cell respiration and photosynthesis. It takes place between redox proteins and in protein complexes that display an outstanding efficiency and environmental adaptability. Although the fundamental aspects of ET processes are well understood, more experimental methods are needed to determine electronic pathways. Understanding how ET works is important not only for fundamental reasons, but also for the potential technological applications of these redox‐active nanoscale systems. The general objective of this thesis is to investigate electron transfer in redox proteins at the single molecule level. To that end, we use Electrochemical Scanning Tunneling Microscopy (ECSTM) and conductive Atomic Force Microscopy (cAFM), excellent tools to study electronic materials and redox molecules including proteins. In this thesis, we focused on two redox protein systems: azurin, a small electron carrier protein and photosystem I, a light‐sensitive oxidoreductase protein complex. In azurin, we studied the protein conductance as a function of its redox state and location on the protein surface, and the effect of technical parameters such as the contact properties between azurin and the metal electrodes, and the mechanical force applied in such contact. For that we adapted our ECSTM setup for an alternating current method often used in ultrahigh vacuum (UHV) STMs. We also worked in the development of a methodology that combines AFM‐based single‐molecule force measurements with single‐molecule electrical measurements, while working in an electrochemically controlled environment. These techniques can lead to a more detailed description of the ET pathways, and to a deeper understanding of the complex relation between the structure of redox proteins and their electronic properties. In photosystem I, developed a method to immobilize complexes on a substrate suitable for ECSTM imaging and spectroscopy, atomically flat gold. In these conditions, we characterized photosystem I by imaging and spectroscopy, and evaluated its conductance and distance‐decay properties in a wide range of biologically relevant electrochemical potentials. The characterization of conduction pathways in redox proteins at the nanoscale would enable important advances in biochemistry and would cause a high impact in the field of nanotechnology.

La transferencia de electrones (ET) desempeña papeles esenciales en procesos biológicos cruciales como la respiración celular y la fotosíntesis. Tiene lugar inter‐ e intra‐ proteínas redox y en complejos de proteínas que muestran una eficiencia excepcional y gran capacidad de adaptación ambiental. Aunque los aspectos fundamentales de los procesos de ET se han estudiado en profundidad, se necesitan más métodos experimentales para determinar las vías electrónicas de ET. La comprensión de cómo funciona la ET es importante no sólo por razones fundamentales, sino también por las potenciales aplicaciones tecnológicas de estos sistemas redox nanoscópicos. El objetivo general de esta tesis es investigar la transferencia de electrones en las proteínas redox a nivel de molécula individual. Para ello utilizamos la Microscopía de Túnel Electroquímico (ECSTM) y la Microscopía de Fuerza Atómica Conductor (cAFM), que son excelentes herramientas para estudiar materiales electrónicos y moléculas redox, incluyendo proteínas. En esta tesis, nos centramos en dos sistemas de proteínas redox: azurina, una pequeña proteína portadora de electrones y el fotosistema I, un complejo de proteína oxidorreductasa sensible a la luz. En el estudio de la azurina, estudiamos la conductancia de las proteínas en función de su estado redox y el efecto de parámetros técnicos como las propiedades de contacto entre la azurina y los electrodos metálicos, y la fuerza mecánica aplicada en dicho contacto. Para ello hemos adaptado nuestra configuración de ECSTM para un método de corriente alterna a menudo utilizado en Microscopía de Túnel de ultra alto vacío (UHV‐STM). También trabajamos en el desarrollo de una metodología que combina medidas de fuerza de una sola molécula basadas en AFM con medidas eléctricas, mientras trabajamos en un ambiente controlado electroquímicamente. Estas técnicas pueden conducir a una comprensión más profunda de las vías de ET y de la compleja relación entre la estructura de las proteínas redox y sus propiedades electrónicas. En el estudio del fotosistema I, desarrollamos un método para inmovilizar complejos sobre un sustrato adecuado para la obtención de imágenes y espectroscopía con ECSTM, oro atómicamente plano. En estas condiciones, caracterizamos el fotosistema I mediante imágenes y espectroscopia, y evaluamos sus propiedades de conductancia y sus parámetros de decaimiento de la corriente con la distancia, en una amplia gama de potenciales electroquímicos biológicamente relevantes. La caracterización de las vías de conducción en las proteínas redox a escala nanométrica puede permitir importantes avances en bioquímica y causar un alto impacto en el campo de la nanotecnología.