Temperature modulated genosensor for detection of cystic fibrosis mutations

Abstract

La memoria de la tesis está organizada en 8 capítulos. Un resumen de cada capítulo se detalla a continuación. <br/>El Capítulo 1 es una Introducción, en la que se presenta el estado del arte así como los objetivos de la tesis. <br/>En el Capítulo 2 se describe el uso de la impedancia electroquímica a diferentes temperaturas para la discriminación de la mutación DF508 con respecto a la secuencia normal sin mutación. Las sondas de DNA (de 15 y 21 bases de longitud) fueron inmovilizadas en la superficie de los electrodos de oro y de la variación de la resistencia a la transferencia de carga (Rct) fue medida en función de la hibridación. Para la detección se han utilizado dos tipos de secuencias diana: secuencias sintéticas 15 mer y dos análogos sintéticos de productos de PCR de 82 (mutante) y 85 (normal) bases. La hibridación con la secuencia corta resulto en una variaciones de Rct muy específicas a la secuencia estudiada, con un factor de discriminación a temperatura ambiente de 5 veces cuando se comparó la respuesta obtenida con la secuencia totalmente complementaria con respecto a las no coincidentes. Sin embargo, en el caso de los productos de PCR sintéticos de cadena sencilla el factor de discriminación fue menor (1.5 veces). Por ellos, el efecto de la temperatura fue investigado como vía para mejorar la discriminación. El uso de lavados post-hibridación a temperatura elevada dio lugar a una mejora de 5 veces en el factor de discriminación. De esta manera, utilizando arrays de electrodos inmovilizadas con sondas selectivas a las secuencias de tipo mutante y normal, se logró una detección inequívoca de la mutación DF508. <br/>En el Capítulo 3 se describe el uso del azul de metileno como indicador electroquímico en la discriminación de la mutación DF508 de fibrosis quística de secuencias normales en productos de PCR. En condiciones experimentales óptimas se obtuvo un factor de discriminación de 1.5 entre el tipo mutante y el normal. El ensayo propuesto es cuantitativo y lineal en el rango de 10 - 100 nM, exhibiendo un límite de detección (LOD) de 2.64 nM. Estudios electroquímicos en distintas condiciones de fuerza iónica permitió elucidar el mecanismo de la interacción de azul de metileno con el DNA y, al parecer, este es el primer reporte sobre la detección de hibridación a través de la interacción guanina específica del MB con de DNA, a diferencia de la interacción electrostática como quedó demostrado en el estudio de la fuerza iónica. La introducción de formamida en el tampón de hibridación para mejorar la discriminación también fue investigada. Por último, a una concentración de 10 nM, la secuencia mutante fue efectivamente discriminada respecto de la normal ajustando los parámetros de configuración de un multi-sensor. <br/><br/><br/>el DNA y, al parecer, este es el primer reporte sobre la detección de hibridación a través de la interacción guanina específica del MB con de DNA, a diferencia de la interacción electrostática como quedó demostrado en el estudio de la fuerza iónica. La introducción de formamida en el tampón de hibridación para mejorar la discriminación también fue investigada. Por último, a una concentración de 10 nM, la secuencia mutante fue efectivamente discriminada respecto de la normal ajustando los parámetros de configuración de un multi-sensor. <br/>El Capítulo 4 presenta un biosensor electroquímico basado en la discriminación de la mutación DF508 de fibrosis quística de secuencias normales en productos de PCR sintéticos. Para ello se empleo una sonda tipo faro molecular de 34 pares de bases complementaria a la mutación DF508 inmovilizada en la superficie de un electrodo de oro y azul de metileno como indicador electroquímico, el cual interacciona con el extremo 5' del faro molecular. La inmovilización del faro molecular en la superficie del electrodo de oro se logró a través un derivado tiolado en el extremo 3' para formar un enlace S-Au en la superficie del electrodo. El efecto de diferentes tipos de tampón (PBS, PBS-T, CSE, HEPES y Trizma) fue investigado. Dos mecanismos de inmovilización fueron examinados en este trabajo: co-inmovilización e inmovilización en dos etapas ("backfilling") con el objetivo de determinar el procedimiento que más tarde sería mejor para la estabilidad de la sonda. También se estudió la temperatura de fusión de la sonda obteniéndose un valor de 31.5ºC, lo cual asegura la estabilidad de la sonda a temperatura ambiente. El tiempo optimo del proceso de hibridación fue de 20 minutos, lo cual segura un ensayo rápido. En condiciones experimentales óptimas se obtuvo un factor de discriminación de 2.5 entre la secuencia mutante y la normal. <br/>En el Capítulo 5 se presenta un método para la determinación precisa de la temperatura de fusión (Tm) de secuencias de DNA de doble hebra inmovilizadas que explota las propiedades de extinción de fluorescencia de superficies de oro. Para ello se empleo una sonda de DNA de cadena simple tiolada quimisorbida en la superficie de oro que se híbrida a una secuencia complementaria marcada con un fluoróforo. Tras la formación del dúplex, la fluorescencia de la etiqueta se extingue de manera efectiva por la superficie de oro. Al aumentar la temperatura y deshibridarse el dúplex, el fluoróforo se mueve lejos de la superficie del oro y la señal de fluorescencia se recupera de nuevo. De esta manera el aumento de la fluorescencia se mide cuando temperatura se eleva <br/>de secuencias relacionadas a la mutación DF508 se determinaron en tres formatos: en disolución, inmovilizados en nanopartículas de oro (Au-NPs) y en chips de oro (Au-chips). progresivamente y graficando la primera derivada de la variación e fluorescencia con respecto a la temperatura se determina Tm. Para demostrar este el enfoque, los valores de Tm <br/>En el Capítulo 6 se introduce una propuesta de discriminación de la mutación DF508 basada en la modificación del DNA a determinar con la etiqueta redox. Para ello se preparó un conjugado de ferroceno con la secuencia mutante (Mut-Fc) que se hibrida con dos posibles secuencias complementarias inmovilizadas en una superficie de oro, una con complementaridad total y otra conteniendo 3 bases no coincidentes. Las diferencias en las señales del ferroceno entre los dos métodos de hibridación se han mejorado estudiando las variaciones de la temperatura de fusión, obteniéndose alrededor de 8 ºC de diferencia en los valores de Tm entre ambas secuencias. La mejor discriminación se obtuvo a 40 ºC, en la que la sonda respecto a la secuencia normal dio una respuesta cercana a cero. Este resultado indica que es posible etiquetar las sondas de PCR con ferroceno con el fin de obtener muestras de DNA real marcadas, lo cual haría posible distinguir entre secuencias mutantes y normales mediante medidas de la temperatura de fusión. <br/>En Capítulo 7 se discute un ensayo basado en mediciones de temperatura de fusión empleando azul de metileno como indicador electroquímico en la discriminación de la mutación DF508 de fibrosis quística de secuencias normales en productos de PCR sintéticos. La sonda complementaria mutante inmovilizada en la superficie de electrodos de oro resultó ser térmicamente estable hasta 70 ºC. La influencia de la fuerza iónica sobre la estabilidad del sistema también se estudió, siendo 0.5 M la concentración de NaCl óptima. El factor de discriminación entre las secuencias de tipo mutante y normal mejoró de 1.1 a 27 ºC hasta 4.26 a 55 ºC. El valor calculado de la temperatura de fusión del dúplex mutante con la secuencia complementaria inmovilizada sobre la superficie del electrodo de oro estuvo de acuerdo con la ecuación de Wallace. El efecto en la estabilidad de dúplex en términos de temperatura de fusión de secuencias laterales situadas en el mutante también fue investigado. <br/>Finalmente, en el Capítulo 8 se presentan las conclusiones principales del trabajo de esta tesis y el trabajo futuro.