Biogénesis e inserción en membranas de proteínas de movimiento de virus vegetales

Abstract

La propagación de una infección viral en plantas está mediada por unas<br/>proteínas codificadas por el propio virus denominadas proteínas de movimiento<br/>(MP). Estas proteínas unen el genoma viral de forma cooperativa y sin<br/>especificidad de secuencia, formando unos complejos RNA-MP, que se asocian,<br/>en la mayoría de casos, al retículo endoplasmático (RE) para ser transportados<br/>muy posiblemente a través del citoesqueleto hacia los plasmodesmos, canales<br/>membranosos que interconectan las células en plantas. Una vez estos complejos<br/>alcanzan los plasmodesmos, el RNA viral es translocado a las células<br/>adyacentes a través de un mecanismo todavía desconocido.<br/>A pesar de la variabilidad entre las distintas familias virales en el<br/>número y tamaño de este tipo de proteínas, se ha descrito que muchas de estas<br/>MPs interaccionan con las membranas celulares. Sin embargo, la naturaleza de<br/>esta interacción y los mecanismos que subyacen a este fenómeno no se han<br/>explorado todavía. Así pues, el objetivo central de la presente tesis se ha basado<br/>en el estudio y caracterización de la asociación de estas proteínas con la<br/>membrana del RE. El virus objeto de estudio ha sido el Virus del Moteado del<br/>Clavel, que codifica dos MPs, p7, una proteína soluble capaz de unir el genoma<br/>viral y p9, que presenta dos regiones hidrofóbicas susceptibles de interaccionar<br/>con las membranas celulares.<br/>En primer lugar, mediante experimentos de transcripción/traducción in<br/>vitro se ha demostrado que p9 es una proteína integral de membrana que<br/>contiene dos fragmentos transmembrana y adopta una orientación N-/Cterminal<br/>citoplasmática.<br/>En segundo lugar, se ha caracterizado el mecanismo a través del cual p9<br/>alcanza las membranas celulares. Los resultados obtenidos demuestran que la<br/>inserción de p9 tiene lugar de forma co-traduccional y es dependiente de SRP,<br/>un complejo ribonucleoproteico que, en general, participa en el<br/>direccionamiento de proteínas a la membrana del RE. Además, el virus explota<br/>la propia maquinaria celular responsable de la integración de las proteínas de<br/>membrana celulares. Así, el complejo Sec61 y la proteína TRAM participan en el<br/>proceso de inserción de p9. Entre los resultados obtenidos cabe destacar que (i)<br/>los segmentos transmembrana de este virus se integran en la membrana a<br/>través de un mecanismo secuencial y ordenado desde Sec61a a TRAM; y (ii) la<br/>proteína TRAM media la integración de esta proteína viral desempeñando una<br/>posible función de reclutamiento de segmentos transmembrana antes de que<br/>éstos particionen conjuntamente a la bicapa lipídica, una vez completada la<br/>traducción de la proteína.<br/>Finalmente, se ha realizado un estudio de los determinantes topológicos<br/>de la proteína que determinan su orientación en la membrana. Se ha explorado<br/>la contribución de toda una serie de parámetros, que se han establecido como<br/>determinantes en el caso de proteínas de membrana de procariotas o eucariotas.<br/>Entre estos factores se encuentran la presencia de residuos cargados en la<br/>secuencia de la proteína, la hidrofobicidad de los fragmentos transmembrana, la<br/>longitud de dominios extramembranosos y/o la presencia de residuos<br/>aromáticos en las regiones flanqueantes de los propios segmentos<br/>transmembrana. Los resultados demuestran que la proteína viral p9 presenta la<br/>información topológica distribuida a lo largo de la secuencia de aminoácidos de<br/>la proteína. Esta estrategia impediría que la posible aparición de una mutación<br/>no conservativa en el gen de la proteína, proceso muy habitual durante la<br/>replicación de los genomas virales, alterara la orientación de la proteína en la<br/>membrana y en definitiva, comprometiese su función biológica.

The cell-to-cell movement of plant virus is assisted by the viral so-called<br/>"movement proteins" (MP). Functions assigned to these proteins include nucleic<br/>acid binding, targeting to the endoplasmic reticulum (ER), and modification of the size<br/>exclusion limit of the plasmodesmata, a membranous channel that connect<br/>adjacent cells. Although the number and size of these proteins vary from viral<br/>families it has been described that many of the viral MPs interact with the membranes<br/>but the nature of this interaction is not well defined yet. Therefore, the main goal of<br/>this study is the characterization of MPs interaction to the ER membranes. The<br/>Carnation Mottle Virus has been used as an experimental model. This virus<br/>encodes two MPs, a cytoplasmic soluble protein of 7 kDa, p7, which binds viral<br/>genome, and a hydrophobic protein of 9 kDa, p9, with two putative<br/>transmembrane segments.<br/>Firstly, it has been demonstrated that p9 is, in fact, an integral membrane<br/>protein containing two transmembrane segments and facing both N- and Cterminus<br/>to the cytosol.<br/>Secondly, it has been dissected the cellular pathway followed by p9 to<br/>reach the host membranes. This viral protein is targeted to ER membrane by the<br/>signal recognition particle, and the translocon components Sec61a and TRAM<br/>mediate p9 integration into the membrane. The unexpected results obtained in<br/>these studies are the following: (i) viral TM fragments integrate into the lipid<br/>bilayer through a sequentially ordered contact to Sec61a and TRAM; and (ii)<br/>TRAM mediates viral protein integration by collecting TM domains, which are<br/>only partitioned into the lipid bilayer after translation termination.<br/>Finally, it has been studied the topological determinants of p9 that<br/>govern the proper orientation of this viral membrane protein. It has been<br/>analysed contribution of different parameters such are distribution of positive<br/>residues along the protein sequence, hydrophobicity of transmembrane<br/>segments, length of extramembranous domains, and presence of aromatic<br/>residues flanking transmembrane domains. The results demonstrate that<br/>topological information of p9 is distributed along the amino acid sequence. This<br/>strategy could avoid any alteration of native topology of p9 due to a random<br/>mutation in the protein gene, a common process during viral genome<br/>replication.