Caracterización molecular de la pérdida del poder patógeno en agrobacterium tumefaciens

Abstract

Agrobacterium tumefaciens es una bacteria fitopatógena causante de tumores en el cuello y raíces de muchas especies vegetales de interés económico. En los viveros e invernaderos es donde más daños produce, al aparecer episodios epidémicos que pueden impedir la comercialización de producciones enteras, porque las plantas afectadas por esta enfermedad no pueden ser comercializadas. Los estudios epidemiológicos y de dinámica de poblaciones del patógeno son poco abundantes y han incidido en aspectos del desarrollo y mantenimiento de la enfermedad producida por la bacteria. Aunque se ha señalado el predominio de cepas no patógenas frente a patógenas en ambientes en los que las cepas productoras de la enfermedad verían favorecido su mantenimiento, apenas se ha investigado la pérdida del poder patógeno en aislados de tumores. <br/>Por tanto, en esta memoria se ha pretendido ampliar el conocimiento sobre la aparición de cepas no patógenas a partir de cepas patógenas en tumores de diversas especies vegetales, huéspedes habituales y no habituales. El objetivo era comprobar si este fenómeno se presenta en la mayoría de cepas de A. tumefaciens, y si existen interacciones con plantas o de otro tipo que favorezcan su aparición. En primer lugar, se ha puesto a punto un método de identificación de cepas individuales de A. tumefaciens, por medio de un sistema de RAPDs, que emplea iniciadores inespecíficos, y que se ha comprobado que es eficaz para diferenciar entre cepas del género Agrobacterium sp.<br/> En segundo lugar, se han llevado a cabo varios experimentos de inoculación de diversos huéspedes vegetales y, de los tumores producidos, se han aislado colonias de las que se ha estudiado el fenotipo patógeno, para comprobar la frecuencia de aparición de este fenómeno y estudiar los cambios que a nivel molecular habían sufrido. También se han llevado a cabo experimentos in vitro, mediante siembras sucesivas en un medio general, para ver si la pérdida del fenotipo patógeno se produce de forma espontánea. <br/> El sistema de identificación mediante RAPDs ha permitido comprobar que, en el análisis de más de 5.000 colonias no patógenas procedentes de los aislamientos realizados en los tumores, solo siete de estas colonias se correspondía con la que previamente se había inoculado en alguno de los huéspedes. El resto eran cepas de Agrobacterium no patógenas de las que se desconoce su origen. Los resultados de este trabajo muestran por tanto, que el fenómeno de la pérdida del poder patógeno se produce, en las condiciones y cepas estudiadas, de forma muy escasa. <br/>La caracterización molecular de los mutantes ha mostrado que 6 de 7 presentan cambios en su plásmido Ti. Entre ellos, inserciones de elementos transponibles en genes de virulencia o mutaciones puntuales. El caso más llamativo es el de dos mutantes que presentan grandes cambios en su plásmido Ti, con un tamaño doble del de la cepa salvaje. El resto de mutantes presenta variaciones en el tamaño o número de plásmidos respecto a las cepas parentales. Los cambios ocurridos parecen implicar grandes reorganizaciones en el genoma de los mutantes, no sólo a nivel del plásmido Ti.

Agrobacterium tumefaciens is the agent of crown gall in many plants of economic interest. The losses are important in greenhouses and nurseries, because of outbreaks that do not allow the marketing of entire productions. Studies on epidemiology are scarce, and they have focused on several aspects about the spread and maintenance of the disease. Although it has been noticed the predominance of non pathogenic strains against pathogenic in environments where the tumorigenic strains would be favored, few studies have been developed on the loss of pathogenicity.<br/> The goal was to increase the knowledge about the appearance of nonpathogenic strains from pathogenic bacteria in tumors produced in different plant species, to see whether this phenomenon occurs in the majority of A. tumefaciens strains, and if they exist interactions with plants that could increase these changes. An identification system to distinguish strains of A. tumefaciens by a RAPD procedure has been set up, and it has proved its validity.<br/> Several inoculation experiments on different hosts have been performed, and from the tumors produced, colonies were isolated and analyzed to see the phenotype pathogen, to determine the frequency of this phenomenon and study the changes they could have undergone. In vitro experiments of successive incubations in a general medium have been performed as well, to examine if this loss of pathogenicity takes place spontaneously.<br/> The identification system by RAPDs has established that among more than 5.000 nonpathogenic colonies isolated from the tumors, only seven correlated with the strains previously inoculated in the hosts. <br/> The results obtained in this work have shown that the loss of pathogenicity takes place, in the conditions and with the strains studied, very scarcely.<br/> The molecular characterization of the mutants has shown that 6 out of 7 found have changes in the Ti plasmid. Among them, the insertion of DNA sequences (IS) into virulence genes or point mutations. In two of the mutants, the alterations have affected the Ti plasmid that it duplicates the size of the parental strain. The changes seem to be due to rearrangements in the genome of the mutants, and in the plasmid.