Papel regulador de la enzina xantina oxidasa en el proceso apoptotico. Estudio en gl¨¢ndula mamaria de rata.

Abstract

La apoptosis es una forma de muerte celular fisiológica con un papel esencial en el desarrollo de los tejidos, su homeostasis, en la respuesta inmune y en la regulación hormonal. Cambios en el mecanismo apoptético están asociados con la fisiopatología del cáncer, SIDA y enfermedades neurodegenerativas. El mecanismo bioquímico del proceso apoptético no se conoce en su totalidad. La generación de radicales libres del oxígeno (ROS) parecen tener un papel importante en este proceso.<br/>La XOR representa una importante fuente de radicales libres tanto de oxígeno (ROS), como de nitrógeno (RNS), a nivel del endotelio capilar, en enterocitos del intestino delgado proximal, en hepatocitos y en las células alveolares pulmonares.<br/>La XOR es la enzima clave en el catabolismo pur¨ªnico, catalizando la oxidación de la hipoxantina a xantina, y de la xantina a ácido úrico. La enzima con localización citoplasmática en distintos tejidos, es una molibdoflavoproteina con un peso molecular de 300kDa. A la XOR se le atribuye un papel antimicrobiano y antiviral, es una componente importante del sistema inmune inespecífico, es capaz de reducir al citocromo c. Interviene en los procesos de fagocitosis, inmovilización del Fe y en lactogenesis.<br/>La actividad de la enzima se ha detectado en la leche humana y en la leche de varios mamíferos. Se sabe que la XOR se produce en la glándula mamaria, pero los estímulos endógenos y el mecanismo molecular responsable de su expresión todavía no se conocen.<br/>La primera parte de la tesis muestra el papel de la XOR durante la involución fisiológica en la glándula mamaria de rata, que se realiza debido a un proceso apoptótico. Se muestra el mecanismo por el cual la XOR controla distintas vías implicadas en apoptosis tras el destete.<br/>Durante la involución de la glándula mamaria, la digestión del DNA tiene lugar a las 12 horas tras el destete.<br/>La oxidación del GSH precede la degradación del DNA nuclear, el estrés oxidativo mitocondrial tiene un papel importante en la inducción del proceso apoptótico.<br/>2<br/>Existe un aumento significativo de la actividad de la XO 24 horas tras el destete.<br/>El incremento de dicha actividad enzimática es debido a un aumento en la actividad proteolítica, de la actividad de las caspasas. El alopurinol administrado disminuye de forma significativa la actividad de la XOR, su inhibición determina una disminución de la apoptosis en el tejido glandular.<br/>El cociente GSSG/GSH disminuye en la sangre y en el tejido mamario. Existe una correlación positiva entre la nitraci¨®n de las proteínas y el porcentaje de células apoptóticas cuando la actividad de la enzima XO es máxima.<br/>El JNK y el p38, proteína kinasas activadas por el estrés durante la apoptosis, se fosforilan tras el destete. La expresión el p53, un gen proapoptótico es evidente.<br/>En la segunda parte del trabajo se muestra la localización mitocondrial de la XO y su implicación el la vías intrínseca de la apoptosis durante la involución de la glándula mamaria de rata.<br/>Después del aislamiento de mitocondrias se ha detectado la expresión de la XO por la técnica de Western Blot y su actividad mitocondrial. Estos resultados muestran que la localización de la XO en la mitocondria representa una nueva fuente de ROS y RNS. La administración del alopurinol disminuye la salida del citocromo c de la mitocondria durante la apoptosis, a 12 horas tras el destete. Por lo tanto la XO mitocondrial representa una clave importante en el control de la apoptosis.

Apoptosis is an active physiological cell death that controls cell populations during embryogenesis, immune response, hormone regulation, and normal tissue homeostasis. Several reports have emphasized the role of oxidative stress and nuclear DNA damage in apoptosis. Xanthine OxidaseReductase (XOR) is one of the major sources of reactive oxygen and nitrogen species (ROS, RNS) which is particularly present at the level of capillary endothelial cells, low but measurable amounts or XOR activity are found in various other cell types. XOR is produced in the mammary gland, however, the refined cellular localization, the endogenous stimuli and the molecular mechanisms responsible for the expression of XOR in mammary gland are yet known.<br/>In the first part of my thesis I show the role of XOR in apoptosis in mammary gland tissue in rat after weaning.<br/>During mammary gland involution, DNA digestion takes place at 12 h after weaning and the glutathione oxidation precedes nuclear DNA degradation. Mitochondrial oxidative stress plays a key role in the induction of the apoptotic process.<br/>There is a significant increase in XO activity at 24 h after weaning. The increase in XO activity could cause by an increased proteolytic activity in the mammary gland, due to increased caspase activity. Allopurinol administration decreased significantly XO activity and its inhibition induces a decrease in apoptosis.<br/>During apoptosis in the mammary gland XO activity rose and the GSSG/GSH ratio in blood and mammary gland increased. There was a positive correlation between protein nitration and percentage of apoptosis when XO activity was higher.<br/>JNK and p38, stress activated protein kinases involved in apoptosis, were phosphorylated during weaning. The expression of p53 and NF¦ÊB were induced too. XO controls the p53 and NF¦ÊB expression to the first period of involution and p38 activity at 48h after weaning.<br/>In the second part of the thesis I tried to demonstrate the possible localization of XO in the mitochondria and its implication during the intrinsic pathway of apoptotic process during the involution of the rat mammary gland.