Caracterización de los repertorios peptídicos asociados a hla-dr en tejido linfoide humano: homeostasis y tolerancia

Abstract

Hipótesis: para la generación eficiente de tolerancia central, los repertorios de péptidos presentados por MHC en el timo debería reflejar el total del proteoma del organismo. Por lo tanto, la transcripción de antígenos periféricos en timo debería corresponder con la presentación de péptidos de estos antígenos. Diferencias cuantitativas o cualitativas entre los péptidos presentados en el timo y en la periferia pueden constituir un factor desencadenante de autoinmunidad. Por tanto, para mantener la tolerancia, los péptidos más abundantes a nivel periférico deberían encontrarse también en el timo.

El trabajo presentado en la tesis describe por primera vez el repertorio peptídico asociado a HLA-DR en timo, órgano linfoide primario donde se genera el repertorio de linfocitos T maduros, y en bazo, órgano linfoide secundario donde se centra la respuesta inmunitaria a antígenos de la sangre. Ambos repertorios están enriquecidos en péptidos derivados de proteínas ubicuas, abundantes en los estromas de cada tejido. Por norma general se presenta una única región de cada proteína, en detrimento del resto de la secuencia (immunodominancia). El estudio comparativo entre tejidos con idéntico tipaje para HLA-DR demostró que los péptidos procedentes de proteínas compartidas proceden de la misma región inmunodominante, lo que sugiere que estos péptidos tolerizados en timo son presentados a nivel periférico para el mantenimiento de la homeostasis. Mediante una metodología de predicción de afinidad de los péptidos asociados a HLA-DR desarrollada en el laboratorio, hemos descrito que los repertorios peptídicos presentados en timo y bazo están compuestos mayoritariamente por ligandos con una alta afinidad hacia las moléculas de DR que la presentan. En comparación con estos repertorios, los péptidos presentados por un tejido autoinmune humano presentan un alto porcentaje de péptidos de baja y media afinidad. A su vez, se han identificado por primera vez dos péptidos derivados de antígenos periféricos presentados por HLA-DR en timos humanos. Estos péptidos proceden de proteínas que son diana de enfermedades autoinmunes humanas. La expresión génica de ambas proteínas se limita a las células del epitelio medular tímico y se asocian de forma diferente al gen AIRE, considerado como el factor de transcripción más importante en la inducción de tolerancia frente a antígenos restringidos de tejido. Muestras y metodología: en colaboración con el Hospital de la Vall d’Hebron y el servicio de trasplantes de la Corporació Sanitària Clínic, se obtuvieron y analizaron 6 muestras de timo procedentes de donantes pediátricos y 4 muestras de bazo de donantes cadavéricos sin patologías autoinmunes descritas en su historial médico. Las moléculas HLA-DR se purificaron y los péptidos se eluyeron en medio ácido. El repertorio fue analizado utilizando espectrometría de masas de alta resolución en colaboración con el laboratorio de proteómica del CSIC-UAB.

Hypothesis: As for the efficient generation of central tolerance, thymus MHC-presented peptide repertoire should reflect the whole organism proteome. Therefore, peripheral antigen transcription in the thymus should correspond with the presentation of these peptides. Quantitative or qualitative differences between the peptides presented in the thymus and in the periphery may be a trigger for autoimmunity. Thus, to maintain the tolerance, the most abundant peptides in the periphery should be found also in the thymus.

The work presented in the thesis describes for the first time the peptide repertoire associated with HLA-DR in the thymus, the primary lymphoid organ where the mature T cell repertoire is generated, and in the spleen, a secondary lymphoid organ where it is focused the immune response to blood antigens. Both repertoires are enriched in peptides derived from ubiquitous proteins, which are abundant in the stroma of every tissue. As a general rule, a single region of each protein is presented at the expense of the rest of the sequence (immunodominance). The comparative study with identical tissue typing for HLA-DR showed that the peptides from shared proteins came from the same immunodominant region, suggesting that these peptides, previously tolerized in the thymus, are presented in the periphery for the maintenance of the homeostasis. An affinity prediction methodology for HLA.DR-associated peptides has been developed in the laboratory. Using this methodology, we have described that peptide repertoires presented in the thymus and the spleen are mainly composed of ligands with high affinity for the DR molecules that present them. Compared to these repertoires, the peptides presented by human autoimmune tissue have a high percentage of low and medium affinity peptides. For the first time, it has been identified two peptides derived from peripheral tissue presented by HLA-DR in human thymi. These peptides derived from proteins that are targets of human autoimmune diseases. Gene expression of both proteins is restricted to thymic medullary epithelia and they associate differently to AIRE gene, which is considered as the most important transcription factor in the induction of tolerance to tissue-restricted antigens. Samples and methodology: in collaboration with the Hospital Vall d'Hebron and the service of the transplants from the Corporació Sanitària Clínic, we obtained and analyzed six thymic samples from pediatric donors and 4 spleen samples from cadavers without autoimmune pathologies described in their medical record. HLA-DR molecules were purified and the peptides were eluted in acid medium. The repertoire was analyzed using high resolution mass spectrometry in collaboration with the proteomics laboratory from CSIC-UAB.