Impact of lighting conditions and feeding cycles rhythms of early development, behaviour and sexual differentiation in zebrafish danio rerio = Impacto de las condiciones de iluminación y ciclo de comida en los ritmos de desarrollo temprano, comportamiento y diferenciación sexual en pez cebra Dario rerio

Abstract

El objetivo de la presente tesis fue investigar el efecto de la luz de diferente longitud de onda y el fotoperiodo durante el desarrollo temprano, el ritmo de eclosión y la actividad locomotora de larvas de pez cebra. Además, el estudio de un sincronizador adicional (alimento) con diferente periodo permitió evaluar los ritmos de alimentación en dos especies. Finalmente, se describió en el pez cebra adulto los ritmos diarios de genes implicados en la diferenciación sexual. Objetivos Específicos 1 Determinar la ontogenia de la expresión de genes reloj (clock1, bmal1, per1b, per2, dbp) larvas de zebrafish sometidos a ciclos de luz-oscuridad de 12:12 horas, y diferente espectro (LDW, LDB, LDR, DD). 2 Investigar la influencia de varias condiciones de iluminación de diferente longitud de onda, sobre la ontogenia de la actividad locomotora de larvas de pez cebra. 3 Determinar el efecto de los cambios de iluminación de diferente espectro de luz (LDW, LDB, LDR) sobre la actividad locomotora de larvas de zebrafish y la presencia de foto receptores capaces de mediar la respuesta a la luz. 4 Describir la existencia de ritmo de eclosión y la sincronización de embriones a diferentes ciclos de luz (LD, DL1, DL2, LL, DD). 5 Evaluar la existencia de actividad anticipatoria a la comida cuando proporcionada de manera periódica en el pez cebra y el pez hipogeo bajo condiciones oscuridad continua y la capacidad de re-sincronización y la presencia de desplazamientos progresivos de la fase. 6 Describir la variación diaria en la expresión de genes involucrados en la diferenciación sexual en macho y hembra de pez cebra adultos. Metodología 1 Los embriones se mantuvieron en condiciones de LD 12:12 horas LDW (blanco), LDB (azul) and LDR (rojo). Las larvas se muestrearon el 0,3,7 dpf a ZT3,9,15,21,3. Se extrajo el ARN y se medio la expresión de los genes con qPCR. 2 Embriones fueron mantenidos en LDW, LDB, LDR. Las larvas se grabaron con una cámara y los videos analizados con un software de seguimiento. 3 Larvas mantenidas bajo LDW, LDB, LDR fueron grabada hasta el 11 dpf con una cámara. El 3 dpf se muestrearon y se analizó la existencia de expresión de los genes con PCR. 4 Embriones bajo LD,DL1,DL2,LL y DD a 28°C. Fueron visualizado cada dos horas para calcular la tasa de eclosión 5 Pez cebra y pez de cueva en DD fueron alimentados en manera periódica con comederos automáticos. Se utilizaron fotocélulas de rayo infrarrojo para la grabación de la actividad locomotora y el software “el Temps” para la representación de los datos. 6 Machos y hembras en ciclo LD 12:12, y 28 ºC, fueron muestreados durante un día ZT2,6,10,14,18,22. cerebro y gónadas, Se midieron lo genes de interés en cerebro y gónadas con qPCR. Conclusiones. 1 La ontogenia de la expresión de los genes reloj se desarrolla de manera diferente dependiendo de los ciclos de luz y también de la longitud de onda. Los genes del bucle negativo (per1b and per2) parecen desarrollar antes la ritmicidad, durante el desarrollo, respeto a aquellos del bucle positivo (clock and bmal) que no resulta dependiente de la luz. 2 La actividad locomotora está influenciada por los ciclos de luz, no mostrando ninguna ritmicidad bajo oscuridad continua. El diferente espectro de la luz influye en el inicio de la ritmicidad de las larvas a diferentes momentos. 3 El incremento de la actividad locomotora debido al cambio de iluminación de los ciclos de luz y del diferente espectro está relacionado con la presencia de varios fotorreceptores no visuales presentes desde el día 3 dpf. 4 La eclosión del pez cebra tiene un ritmo diario y está sincronizada a los ciclos de luz-oscuridad. La fase de este ritmo depende del tipo de ciclo de iluminación. 5 La actividad de anticipación al alimento es de origen endógeno en las dos especies. El pez cebra tiene una elevada plasticidad en el encarrilamiento de su ritmo a ciclos de comida de periodo diferente de 24 horas y presenta resincronización gradual tras retrasar la hora de alimentación. 6 La expresión de genes involucrados en la diferenciación sexual en adultos varia durante el día y la fase depende del ciclo de luz y del sexo.

Summary of Doctoral Thesis entitled “Impact of lighting conditions and feeding cycles on rhythms of early development, behaviour and sexual differentiation in zebrafish Danio rerio”. The aim of the present thesis was to investigate the effect of light of different wavelength and photoperiod on early development, hatching rhythms and locomotor activity of zebrafish larvae. Morover, the study of an additional zeitgeber (food) permitted to evaluate the feeding rhythms synchronized to different feeding period in adult zebrafish and cavefish blind specie. Finally we aims to describe in adult zebrafish, the daily rhythms of genes involved on sexual differentiation. In the present Doctoral thesis the specific objectives were established: 1 To determine the ontogeny of zebrafish larvae clock genes expression (clock1, bmal1, per1b, per2 dbp) under light-dark cycle of 12:12 hours and different spectrum (LDW, LDB, LDR, DD). 2 To investigate the influence of several lighting conditions of different wavelength on the ontogeny of locomotor activity of zebrafish larvae. 3 To determine the effect of illumination changes of different light spectrum (LDW, LDB, LDR) on locomotor activity of zebrafish larvae and the presence of photo receptors capable to mediate the response to light. 4 To describe the existence of hatching rhythms and embryo synchronization to different light cycle (LD, DL 1, DL2, LL, DD). 5 To evaluate the existence of feeding anticipatory activity when food is periodically provided in zebrafish and cavefish under continuous dark conditions. Evaluate the ability of the fish to re-synchronize when feeding time is delayed. 6 To describe the daily variation in the expression of genes involved in sexual differentiation into male and female zebrafish adults. Methodology 1. Embryos were maintained under LD 12:12 LDW (white), LDB (blue) and LDR (red). Larvae were sampled at 0,3,7 dpf and different time point ZT3,9,15,21. RNA was extracted and the gene expression analyzed with qPCR. 2. Embryos were kept in LDW, LDB, LDR. The larvae were recorded with a video camera and analyzed with specialized tracking software. 3. The larvae kept under LDW, LDB, LDR were recorded until 11 dpf with a camera. At 3 dpf were sampled and the presence of gene expression analyzed by PCR. 4. Embryos under LD, DL, DL, LL and DD at 28 ° C. They were visually analyzed every two hours to calculate hatching rate. 5. Zebrafish and cavefish were fed periodically with automatic feeder. Photocell with infrared beam were used to record the locomotor activity and a software "El Temps" used for data representation. 6 Zebrafish males and females maintained under cycle LD 12:12, and 28 degrees, were sampled during a day at different time point ZT2,6,10,14,18,22. The expression genes were measured in gonads and brain of both sexes with qPCR. Conclusions. 1. The ontogeny of clock genes expression develops differently depending on the light cycles and the wavelength of the light. The genes of the negative loop (per1b and per2) develop rhythmicity before, during development, respect those positive loop (clock and bmal). 2. The locomotor activity is strongly influenced by light cycles, showing no rhythmicity under continuous darkness. The different spectrum of light induces the asynchronous start of locomotor rhythmicity in larvae. 3. The locomotor activity increment as response of illumination change of different spectrum of the light cycles is related to the presence of several non visual photoreceptors already at 3 dpf. 4. Zebrafish hatch rhythmically during the light phase, appearing strongly synchronized to light-dark cycles. The phase of this rhythm at constant temperature depends on the lighting cycle. 5. The feeding anticipatory activity has endogenous origin in both species. The oscillator appears to posses: high plasticity in the synchronization of its rhythm to feeding cycle different of 24-hour and ability to re-synchronize when feeding time is delayed. 6. The expression of genes involved in sexual differentiation in adults varies during the day and the phase depends on the light cycle and sex.