Funció de SDC2 i ERK5 en la regulació de l'expressió en la superfície cel·lular del complex TCR/CD3 i LFA-1

Abstract

Els limfòcits T inicien i regulen la resposta immunitària adaptativa contra infeccions i càncers, i juguen un rol fonamental en al·lèrgies, malalties autoimmunes i rebuig de transplantaments. Aquestes funcions depenen del reconeixement d’antígens immunogènics presentats per cèl·lules presentadores d’antigen per part del complex TCR/CD3 present en la superfície cel·lular dels limfòcits T, un reconeixement que en cas de ser productiu i en concert amb senyals co-estimuladors porta a l’activació del limfòcit T. L’adhesió amb la cèl·lula presentadora d’antigen depèn de la integrina LFA-1, la qual també regula l’adhesió al endoteli durant la migració dels limfòcits T a la zona on han d’exercir la seva funció. Per tant, la correcta regulació del complex TCR/CD3 i la integrina LFA-1 és clau per la correcta adhesió i activació dels limfòcits T.

Els limfòcits T expressen els proteoglicans heparà-sulfat sindecà-2 (SDC2) i sindecà-4 (SDC4). SDC4 presenta un rol inhibitori en aquests tipus cel·lular, però la funció de SDC2 es desconeix. Per tal d’examinar la funció de SDC2 l’hem sobre-expressat en limfòcits Jurkat, una línia cel·lular. La sobre-expressió de SDC2 redueix l’expressió en la superfície cel·lular de la integrina LFA-1 i la bloqueja en un estat de baixa afinitat, fet que provoca una reducció de l’adhesió d’aquests limfòcits a l’endoteli o a cèl·lula presentadora d’antigen. El domini EFYA de la regió citoplasmàtica de SDC2 és necessari per bloquejar LFA-1 en una conformació de baixa afinitat i per reduir l’adhesió. Les tirosines 179 i 191 i les serines 187 i 188 també contribueixen al bloqueig de LFA-1 en una conformació de baixa afinitat. A més, la sobre-expressió de SDC2 redueix l’expressió en la superfície cel·lular del complex TCR/CD3, degut a la retenció de la subunitat CD3e a l’interior cel·lular i a la degradació parcial de la subunitat TCRz. La reducció del TCR/CD3 incapacita aquests limfòcits T a respondre correctament a l’activació a través d’aquest complex.

En paral·lel, en aquesta tesi també hem demostrat que la MAPK ERK5 presenta un rol dual i antagònic en la regulació de l’expressió en la superfície cel·lular del complex TCR/CD3. D’una banda promou la reducció de l’expressió en la superfície cel·lular del complex TCR/CD3 degut a la degradació de la subunitat TCRz d’aquest complex. El knockdown d’ERK5 en limfòcits Jurkat incrementa l’expressió en la superfície cel·lular del complex TCR/CD3 i augmenta l’expressió de la subunitat TCRz d’aquest complex. La inhibició de la fosforilació d’ERK5 depenent de MEK5 en limfòcits T CD4+ humans redueix l’ubiquitinació i degradació de TCRz, limitant així la reducció de l’expressió en la superfície cel·lular del complex TCR/CD3 després de l’activació del limfòcit T. El knock-out d’Erk5 en timòcits de ratolí augmenta l’expressió de TCRz i incrementa l’expressió en la superfície cel·lular del complex TCR/CD3, fet que correlaciona amb un increment de la generació de timòcits CD4+CD8-CD25+. D’altra banda, el knockdown d’ERK5 en limfòcits Jurkat i la inhibició de l’auto-fosforilació del domini C-terminal d’ERK5 en limfòcits T CD4+ humans presenten una reducció de l’expressió en la superfície cel·lular del complex TCR/CD3 després de retirar l’estímul activador del limfòcit T, indicant que ERK5 promou la recuperació de l’expressió en la superfície cel·lular del complex TCR/CD3 després de l’activació.

En resum, els nostres resultats proposen el proteoglicà SDC2 com a inhibidor de l’activació i l’adhesió dels limfòcit T degut a la funció que exerceix durant l’expressió en la superfície cel·lular del complex TCR/CD3 i l’activació de la integrina LFA-1. A més, els nostres resultats defineixen la MAPK ERK5 com a moduladora de l’expressió en la superfície cel·lular del complex TCR/CD3.

Regulation of the TCR/CD3 complex and integrin LFA-1 expression at the cell surface is critical to proper T cell adhesion and activation.

T cells express the heparan sulphate proteoglycans syndecan-2 (SDC2) and syndecan-4 (SDC4). SDC4 plays a T cell inhibitory role, however, the function of SDC2 in T cells is unknown. In an attempt to examine this function, SDC2 was expressed constitutively in Jurkat T cells. Here, we show the down-regulation of LFA-1 and inhibition of adhesion of Jurkat T cells transfected with SDC2. The PDZ-binding domain in the cytoplasmic region of SDC2 was necessary to block the LFA-1 high-affinity conformation, and to reduce cellular adhesion. A second cytoplasmic motif comprising tyrosines 179 and 191, and serines 187 and 188 contributed also to reduce LFA-1 function and cellular adhesion. Moreover, the expression of SDC2 decreased the surface levels of TCR/CD3 complex, concomitant with intracellular retention of CD3e and partial degradation of the TCRz chain. The lower TCR/CD3 surface levels caused by SDC2 led to reduced TCR/CD3 responsiveness.

We also provide evidence that the MAPK ERK5 regulates the surface expression of the TCR/CD3 complex by controlling the degradation of the TCRz chain and the recovery of the complex after anti-CD3e stimulation. ERK5 knockdown led to TCR/CD3 up-regulation at the cell surface and increased amounts of the TCRz chain. Inhibition of the MEK5-dependent phosphorylation status of the kinase domain of ERK5 in human T CD4+ cells reduced TCRz ubiquitination and degradation, limiting TCR/CD3 down-regulation in anti-CD3e-stimulated cells. Moreover, TCR/CD3 recovery at the cell surface, after anti-CD3e treatment, is impaired by ERK5 knockdown or pharmacological inhibition of autophosphorylation in the ERK5 C-terminal region. ERK5 loss in thymocytes augmented cellular TCRz and increased cell surface levels of TCR/CD3 on CD4+CD8+ thymocytes. This correlated with enhanced generation of CD4+CD8-CD25+ thymocytes.

In conclusion, our results propose SDC2 as an inhibitor of T cell adhesion and activation, due to its regulation of TCR/CD3 complex expression at the cell surface and LFA-1 integrin activation. Moreover, our study identifies ERK5 as a novel kinase that modulates TCR/CD3 expression at the cell surface in mouse and human T cells.