Nanostructured coatings for controlling bacterial biofilms and antibiotic resistance

Abstract

The accelerated emergence of drug resistant bacteria is one of the most serious problems in healthcare and the difficulties in finding new antibiotics make it even more challenging. To overcome the action of antibiotics bacteria develop effective resistance mechanisms including the formation of biofilms. Biofilms are bacterial communities of cells embedded in a self-produced polymeric matrix commonly found on medical devices such as indwelling catheters. When pathogens adopt this mode of growth on the surface, they effectively circumvent host immune defences and antibiotic therapy, causing severe and life threatening infections. This thesis focuses on the development of advanced nanoscale materials and coatings for controlling bacterial biofilms and the emergence of drug resistance. To this end, acylase and amylase enzymes degrading essential for the biofilm growth components, were innovatively combined into hybrid nanocoatings to impart antibiofilm functionalities onto indwelling medical devices. Alternatively, ultrasound-assisted nanotransformation of antimicrobials was used as a tool for enhancing their antibacterial efficacy and overcoming the intrinsic drug resistant mechanisms in Gram-negative bacteria. These strategies offer new perspectives for prevention and treatment of biofilm infections, limiting the selection and spread of antibiotic resistance. The first part of the thesis describes the building of enzyme multilayer coatings able to interfere with bacterial quorum sensing (QS) and prevent biofilm establishment on silicone urinary catheters. This was achieved by alternate deposition of negatively charged acylase and oppositely charged polyethylenimine in a Layer-by-Layer (LbL) fashion. The acylase-coated catheters degraded bacterial signalling molecules and inhibited the QS process of Gram-negative bacteria. These coatings also significantly reduced the biofilm growth on urinary catheters under conditions mimicking the real situation in catheterised patients, without affecting the human cells viability. Acylase was further combined with the matrix degrading amylase enzyme into hybrid multilayer coatings able to interfere simultaneously with bacterial QS signals and biofilm integrity. The LbL assembly of both enzymes into hybrid nanocoatings resulted in stronger biofilm inhibition as a function of acylase or amylase location in the multi-layer coating. Hybrid nanocoatings with the QS inhibiting acylase as outermost layer reduced the occurrence of single and multi-species biofilms on silicone catheters in vitro and in an in vivo animal model. The thesis also reports on the efficacy of nanomaterials for prevention and eradication of antibiotic resistant biofilms. Multilayer assemblies that contain in their structure and release on demand antibacterial polycationic nanospheres (NSs) were engineered on silicone surfaces. A polycationic aminocellulose (AC) conjugate was first transformed into NSs with enhanced bactericidal activity and then combined with hyaluronic acid to build bacteria-responsive layers on silicone material. When challenged with bacteria these multilayers disassembled gradually inhibiting both planktonic and biofilm modes of bacterial growth. The same AC NSs were also covalently immobilised on silicone material using epoxy-amine conjugation chemistry. The intact NSs on the silicone material were able to inhibit bacterial biofilm growth, suggesting the potential of epoxy-amine curing reaction for generation of stable non-leaching coatings on silicone-based medical devices. Finally, ultrasound-assisted nanotransformation of penicillin G was used as a strategy to boost its activity towards bacteria. The efficient penetration of the NSs within a biomimetic membranes sustained the theory that they may reach the periplasmic space in Gram-negative bacteria and exert their bactericidal activity "unrecognised" as a threat by bacteria for selection of resistance.

La rápida aparición de bacterias resistentes a fármacos es uno de los problemas más graves del sistema sanitario convirtiéndose en un gran reto encontrar nuevos antibióticos. Para superar la acción de los antibióticos, las bacterias utilizan diferentes mecanismos de resistencia incluyendo la formación de biopelículas. Las biopelículas son comunidades complejas de células bacterianas unidas por una matriz polimérica comúnmente encontradas en dispositivos médicos invasivos como los catéteres urinarios. Cuando los patógenos adoptan este modo de crecimiento en superficies, evitan eficazmente las defensas inmunitarias y el efecto de los antibióticos, causando infecciones. Esta tesis se centra en el desarrollo de nuevos materiales y recubrimientos nanoestructurados para el control de biopelículas bacterianas y la reducción de su resistencia a antibióticos. Por lo tanto, las enzimas acilasa y amilasa, capaces de degradar los componentes necesarios de las bacterias para formar biopelículas, se combinaron de forma innovadora en nanorecubrimientos híbridos para intervenir en el crecimiento de las biopelículas en dispositivos médicos permanentes. Además, la transformación de agentes antimicrobianos a forma "nano" se utilizó para mejorar su eficacia antibacteriana y superarlos mecanismos de resistencia a fármacos de las bacterias. Estas estrategias ofrecen nuevas perspectivas para el tratamiento de las infecciones relacionadas con biopelículas, limitando la selección y propagación de la resistencia bacteriana. La primera parte de la tesis describe la generación de recubrimientos multicapa de enzimas capaces de interferir con el sistema de comunicación bacteriana, denominado quórum sensing (QS) y prevenir la formación de biopelículas en el superficie de los catéteres urinarios. Esto se consiguió por deposición alternada de acilasa, cargada negativamente, y polietilenimina, cargada de manera opuesta, en la forma de capa a capa (LbL). Los catéteres recubiertos con acilasa inhibieron el proceso QS de bacterias Gram-negativas y redujeron significativamente el crecimiento de biopelículas en los catéteres urinarios en condiciones que imitaban la situación real en pacientes cateterizados. Adicionalmente, la acilasa se combinó con la enzima amilasa en recubrimientos híbridos capaces de interferir con las señales de comunicación entre bacterias y la integridad de la matriz de la biopelícula. El ensamblaje de las dos enzimas en recubrimientos híbridos dio lugar a una inhibición de la formación de biopelículas más fuerte en función de la localización de la acilasa o de la amilasa en la multicapa. Nanorecubrimientos con acilasa en la capa más externa redujo la formación de biopelículas en catéteres de silicona in vitro y en un modelo animal in vivo. La tesis también muestra la eficacia de nanomateriales para el control de biopelículas bacterianas. Las nanoesferas (NSs) antibacterianas, que contienen en su estructura multicapas ensambladas que se liberan bajo demanda, fueron depositados sobre silicona. Aminocelulosa (AC) se transformó primero en NSs obteniendo una mejor actividad bactericida y luego se combinó con ácido hialurónico para construir capas sensibles a las bacterias. Cuando se ponen en contacto con bacterias, estas capas se desmontan gradualmente inhibiendo las formas planctónicas y biopelículas. Los mismos ACNS también se inmovilizaron sobre silicona usando epoxi-amina. Las NSs intactas fueron capaces de inhibir el crecimiento de la biopelícula, lo que demuestra el potencial de la reacción de epoxi-amina para la generación de recubrimientos estables en dispositivos médicos de silicona. Finalmente, la nanotransformación de la penicilina G se utilizó como otra estrategia para aumentar la actividad del antibiótico hacia bacterias. Se demostró la a penetración efectiva de las partículas dentro de membrananas biomimeticas sugiera que las partículas alcanzan el espacio periplásmico en las bacterias y ejercen su actividad bactericida.