Producció de transglutaminasa de blat de moro (TGZ) en Escherichia coli i Pichia pastoris: Estudi i millora del procés

Abstract

La transglutaminasa (TGasa) és un enzim que catalitza modificacions postraduccionals de proteïnes mitjançant enllaços ε-(γ-glutamil) i ponts covalents d’amida. En plantes, aquest enzim està poc estudiat, i només ha estat clonat el gen TGasa de Zea mays (tgz). Aquesta tesi resumeix la feina feta per desenvolupar un sistema d'expressió utilitzant dos microorganismes recombinants, Escherichia coli (E. coli) i Pichia pastoris (P. pastoris) per produir i caracteritzar l'enzim transglutaminasa (TGZ). Treballs anteriors en E. coli van mostrar que la proteïna recombinant era present principalment en forma de cossos d'inclusió (IBs). Per tal d'obtenir la proteïna en forma activa i soluble, es van optimitzar les condicions d'expressió en E. coli. Es va assajar la coexpressió de xaperones i es va desenvolupar un sistema no clàssic de solubilització de IBs. A més, es va transformar P. pastoris per estudiar la seva expressió i comparar ambdós sistemes. Les metodologies de Taguchi i de la superfície de resposta es van utilitzar per formular un medi de cultiu que, juntament amb el desenvolupament d’una aplicació informàtica per modelar i simular el procés, va permetre establir un cultiu d'alta densitat d'E coli. Els resultats van mostrar que les condicions òptimes per a expressar TGZ en E. coli van ser d’una concentració de IPTG de 100μmol IPTG / g de biomassa seca i un temps d'inducció de 5 h. Aquestes condicions van permetre obtenir un rendiment TGZ de 160 mg / L amb una activitat específica de 450 putrescina pmol / mg TGZ resolubilitzada · h. Es va realitzar una caracterització bioquímica completa de la TGZ obtinguda mitjançant E. coli. Es va posar a punt un sistema de cultiu d'alta densitat cel·lular en P. pastoris i es va expressar TGZ amb èxit. La reacció de reticulació de TGZ a la caseïna es va estudiar, i el resultat va ser igual que la reacció de la caseïna per TGZ expressada en E. coli. Es va obtenir una producció de 480 mg / L de proteïna total amb una activitat de 4000 pmol putrescina / mg de proteïna total · h. Aquests resultats indiquen que també es va establir un procediment eficaç per expressar TGZ en P. pastoris.

La transglutaminasa (TGasa) es una enzima que cataliza modificaciones postraduccionales de proteínas mediante enlaces ε- (γ-glutamil) y puentes covalentes de amida. En plantas, esta enzima está poco estudiada, y sólo ha sido clonado el gen TGasa de Zea mays (tgz). Esta tesis resume el trabajo realizado para desarrollar un sistema de expresión utilizando dos microorganismos recombinantes, Escherichia coli (E. coli) y Pichia pastoris (P. pastoris) para producir y caracterizar la enzima transglutaminasa (TGZ). Trabajos anteriores en E. coli mostraron que la proteína recombinante estaba presente principalmente en forma de cuerpos de inclusión (IBs). Con el fin de obtener la proteína en forma activa y soluble, se optimizaron las condiciones de expresión en E. coli. Se ensayó la coexpresión de chaperonas y se desarrolló un sistema no clásico de solubilización de IBs. Además, se transformó P. pastoris para estudiar su expresión y comparar ambos sistemas. Se utilizaron las metodologías de Taguchi y de la superficie de respuesta para formular un medio de cultivo que, junto con el desarrollo de una aplicación informática para modelar y simular el proceso, permitieron establecer un cultivo de alta densidad de E. coli. Los resultados mostraron que las condiciones óptimas para expresar TGZ en E. coli fueron de una concentración de IPTG de 100μmol IPTG / g de biomasa seca y un tiempo de inducción de 5 h. Estas condiciones permitieron obtener un rendimiento TGZ de 160 mg / L con una actividad específica de 450 putrescina pmol / mg TGZ resolubilizada · h. Se realizó una caracterización bioquímica completa de la TGZ obtenida mediante E. coli. Se puso a punto un sistema de cultivo de alta densidad celular en P. pastoris y se expresó TGZ con éxito. La reacción de reticulación de TGZ en la caseína se estudió, y el resultado fue igual que la reacción de la caseína por TGZ expresada en E. coli. Se obtuvo una producción de 480 mg / L de proteína total con una actividad de 4000 pmol putrescina / mg de proteína total · h. Estos resultados indican que también se estableció un procedimiento eficaz para expresar TGZ en P. pastoris.

Transglutaminase (TGase) is an enzyme that catalyzes post-translational protein modifications by ε-(γ-glutamyl) links and covalent amide bonds. In plant, this enzyme is poorly studied and only the Zea mays TGase gene (tgz) has been cloned. This thesis summarizes the work done to develop an expression system using two recombinant microorganisms, Escherichia coli (E. coli) and Pichia pastoris (P. pastoris) to produce and characterize the enzyme transglutaminase (TGZ). Previous works expressing TGZ in E. coli showed that the recombinant protein was mainly present as inclusion bodies (IBs). In order to obtain active, soluble protein, expression conditions were optimized in E. coli, coexpression of chaperones was tested and a non-classic IBs resolubilizing system was developed. Additionally, the gene was also inserted in P. pastoris to study its expression, being able to compare both systems. Taguchi and response surface methodologies were used to develop a culture media that, together with the implementation of a computer application to model and simulate the process, allowed to develop a high-density culture of E. coli. Results showed that the optimal conditions to express TGZ in E. coli were an IPTG concentration of 100µmol IPTG/ g dry biomass and an induction time of 5h. These conditions allowed to obtain a TGZ yield of 160 mg/L with a specific activity of 450 pmol putrescine/mg resolubilized TGZ·h. A full biochemical characterization of the TGZ obtained using E. coli was performed. A P. pastoris high cell density cultivation system was implemented and TGZ was successfully expressed. The cross-linking reaction of TGZ to the casein was also studied, and the result was same as the reaction of casein by TGZ expressed in E. coli. A production of 480mg/L of total protein with an activity of 4000 pmol putrescine/mg total protein·h was obtained. These results indicated that an effective procedure for expressing TGZ in P. pastoris was also established.