Caracterización de células tumorales circulantes en pacientes con carcinoma hepatocelular. Función de EpCAM en la metástasis

Abstract

ANTECEDENTES: El carcinoma hepatocelular (CHC) es el cáncer de hígado más frecuente y la sexta neoplasia con mayor incidencia mundial. Constituye la tercera causa de muerte por cáncer y la decimosexta causa a nivel mundial (Forner, 2016). Afecta principalmente a individuos con enfermedad hepática crónica que han desarrollado cirrosis (Naghvi, 2014, Forner, 2016). En la metástasis las células que se liberan del tumor pasan al torrente sanguíneo como células tumorales circulantes (CTCs) (Bednarz-Knoll, 2012; Entenberg, 2013). La determinación de CTCs se basa en detectar marcadores específicos indicativos de su presencia. Su detección es útil para valorar el pronóstico o predecir la respuesta terapéutica (Hofman, 2016). “Epithelial Cell Adhesion Molecule” (EpCAM) es una glicoproteína transmembrana de adhesión intercelular. En un hígado adulto sano se expresa en colangiocitos y células progenitoras, re- expresándose en hepatocitos durante la hepatocarcinogénesis (Imrich, 2012). EpCAM en células transformadas se asocia a mayor proliferación y migración (Munz, 2004), empeorando el pronóstico de la enfermedad. Está descrito que EpCAM regula la expresión de c-MYC, CICLINA D1 y β-CATENINA (Maetzel, 2009), sin embargo, se desconoce su papel en el desarrollo tumoral.

OBJETIVOS: - Detectar y caracterizar CTCs en pacientes con CHC. Aproximación al sistema CellSearch (Veridex). Analizar nuevos marcadores potenciales mediante Real Time-qPCR. Validar el nuevo marcador MUC1. - Estudiar la función de EpCAM en la metástasis del CHC (proliferación, invasión y migración celular).

METODOLOGÍA: Análisis de CTCs en muestras de sangre de pacientes con CHC utilizando CellSearch (Veridex), Real Time-qPCR e ImageStream AMNIS (Merck Millipore). Transfección del vector pCMV6- EPCAM-GFP en las líneas celulares de CHC humano BCLC5 y BCLC6 y generación de líneas estables mediante selección de células EpCAM-GFP positivas por FACS. Determinación de expresión génica (Real Time-qPCR) y proteica (Western Blot) de marcadores de proliferación, transformación celular, epiteliales y mesenquimales. Procesamiento y localización de EpICD por inmunofluorescencia. Análisis de proliferación mediante ensayo cristal violeta, migración

por ensayo scratch e invasión mediante ensayo sobre matrigel. Determinación de formación de esferoides tumorales utilizando placas no adherentes. Como control positivo utilizamos la línea BCLC9 de CHC humano con expresión de EpCAM. Caracterización celular tras el silenciamiento de CLDN7. Modelo murino de tumor xenograft para analizar el efecto de EpCAM en la formación de tumores.

RESULTADOS Y CONCLUSIONES: EpCAM no es buen marcador de CTCs en nuestros pacientes con CHC. Real Time-qPCR e ImageStream AMNIS (Merck Millipore) permiten identificar MUC1 como potencial marcador en estos pacientes.

EpCAM limita la capacidad de migración celular, interviene en la formación de mayor número de esferoides tumorales e induce la expresión de vimentina.

Ni EpCAM ni CLDN7 modifican la proliferación ni invasión celular. Ambas contactan en la membrana y en el núcleo de las células. La localización de CLDN7 depende de la línea celular y de si ésta crece en dos o en tres dimensiones y es independiente de su estado de fosforilación. Ambas proteínas tienen efecto aditivo en la generación de esferoides tumorales.

In vivo la expresión de EpCAM favorece la formación de tumores antes que las células sin expresión. El tamaño de los tumores generados por células positivas para EpCAM es mayor que los obtenidos por líneas celulares sin EpCAM.

DISCUSIÓN: El papel de EpCAM durante la metástasis es complejo. Las controversias sobre su función en la metástasis y el hecho de que su expresión sea muy baja en nuestros pacientes con CHC, muestran la necesidad de encontrar nuevos marcadores para detectar CTCs. Hemos demostrado la asociación de EpCAM con CLDN7 en el núcleo celular. La relación entre EpCAM y la capacidad de formar mayor número de esferoides abre un nuevo campo de estudio sobre su papel en la migración colectiva.

BACKGROUND: Hepatocellular carcinoma (HCC) is the most frequent liver cancer and the third cause of cancer related death worldwide. Its development occurs mainly on cirrhotic liver (Forner, 2016). Circulating tumor cells (CTC) are cells from the tumor that are released into the blood (Bednarz-Knoll, 2012). CTC detection is useful to know tumor prognosis and therapeutic response (Hofman, 2016).

Epithelial Cell Adhesion Molecule (EpCAM) is a transmembrane glycoprotein which mediates intercellular adhesions. EpCAM is restricted to cholangiocytes and progenitor cells in healthy adult liver. Its presence has been described in hepatocytes during hepatocarcinogenesis (Imrich, 2012). It is associated to proliferation and migration in malignant cells (Munz, 2004). Although EpCAM regulates c-MYC, CYCLIN D1 and β-CATENIN expression (Maetzel, 2009), its contribution to tumor evolution is unknown.

AIMS: - CTC detection and characterization in patients with HCC. - To study EpCAM functions in HCC metastasis.

METHODOLOGY: CTCs analysis by CellSearch system (Veridex), Real Time-qPCR and ImageStream AMNIS (Merck Millipore). EpCAM expression was forced on BCLC5 and BCLC6 HCC cell lines by pCMV6- EPCAM-GFP vector transfection. Its effect on these cells was analyzed by using BCLC9 HCC cell line as a control due to its EpCAM endogenous expression. Mice xenograft model was used to analyze EpCAM in tumor formation.

RESULTS: EpCAM is not a useful CTC marker in our HCC patients. MUC1 is a potential marker in these patients. Migration is limited by EpCAM in our cell lines. EpCAM induces vimentin expression and increases tumor spheroid generation. Neither proliferative nor invasive capacities are modified by EpCAM or CLDN7. Both proteins interact in cell membrane and nucleus. CLDN7 localization depends on cell line but it is phosphorylation independent. CLDN7 localization depends on flat or 3D cell culture. EpCAM and CLDN7 have additive effect on spheroid tumor formation. In vivo, cell lines with EpCAM expression generate bigger tumors and more rapidly than those without EpCAM.

DISCUSSION: EpCAM’s role in HCC metastasis is controversial. Most of our patients do not express EpCAM in CTCs. This shows the necessity to find new CTC markers. EpCAM related to tumor spheroids generates a new study field on collective cell migration.