Estudis bioquímics i estructurals de diferents formes de nucleoplasmina. Interacció amb histones i altres proteïnes bàsiques.

Abstract

La nucleoplasmina (NP) és la proteïna majoritària del nucli dels oòcits i ous no fecundats de la granota "Xenopus laevis" i altres amfibis. Es tracta d'una proteïna acídica amb tres trams acídics principals (A1, A2, A3). La NP participa en la remodelació de la cromatina durant la fecundació, mediatitzant la descondensació de la cromatina espermàtica i facilitant l'acoblament de nucleosomes gràcies a la seva funció de xaperona molecular. <br/>En el decurs d'aquest treball s'ha continuat l'estudi dels diferents recombinants de la NP de què disposem, posant especial èmfasi en la forma mutant r-NP142, que es caracteritza pel fet que té el tram acídic principal A2 molt exposat. Interessava determinar la influència de diferents condicions en l'estabilitat i el grau de pentamerització de la molècula. En aquesta mateixa línia es va estudiar el paper de les Cys de la NP en la pentamerització. Mitjançant mutagènesi dirigida es van substituir les Cys per Ser i es va observar que concretament la mutació de la Cys 45 afavoria la monomerització de la forma r-NP142, però no afectava l'oligomerització de les formes r-NP i r-NP121, les quals romanien pentamèriques. Aquests resultats suggereixen que no hi hauria ponts disofre en l'estructura pentamèrica de la nucleoplasmina. La caracterització estructural de la nucleoplasmina es va intentar abordar a diferents nivells. A nivell de l'estructura secundària, es van utilitzar tècniques de dicroisme circular. Concretament es va determinar que el mutant r-NP142 C45S tenia una estructura plegada a l'atzar (random coil). D'altra banda, per a ordres estructurals superiors es van utilitzar tècniques de microscòpia electrònica i tècniques cristal·logràfiques. <br/>Un altre objectiu d'aquest treball va ser la caracterització de les interaccions de l'NP amb histones del nucli del nucleosoma. Estàvem especialment interessats a veure si la interacció NP-histones era fonamentalment de tipus electrostàtic o bé podria tractar-se d'algun altre tipus d'interacció. Mitjançant ultracentrifugació analítica i gradients de sacarosa es va poder determinar que la NP podia unir els quatre tipus d'histones nucleosòmiques. Aquesta unió tindria una estequiometria corresponent a 1 mol de pentàmer de NP per mol d'octàmer d'histones. Cal destacar que la NP pot unir també histones tripsinitzades (sense les cues bàsiques) mantenint la mateixa estequiometria que per al cas de les histones natives. Així mateix, la forma r-NP121 (sense el tram acídic A2) és capaç d'unir histones natives amb la mateixa estequiometria descrita per als casos anteriors. Aquests experiments indiquen que la interacció NP-histones no seria predominantment electrostàtica. <br/>Un altra línia de treball va ser estudiar la presència o no d'una NP-like a l'extracte d'oòcits de l'estrella de mar "Echinaster sepositus". S'ha trobat una proteïna majoritària que presenta les propietats de ser termoestable, acídica i parcialment resistent al sulfat amònic. Aquesta proteïna és reconeguda pels anticossos policlonals antinucleoplasmina obtinguts en ous de gallina. D'altra banda, no és capaç de descondensar nuclis espermàtics que contenen protamina.<br/>El darrer objectiu del treball va ser l'estudi estructural de la proteïna ?0. La ?0 és específica del nucli espermàtic de l'equinoderm "Holothuria tubulosa" i presenta propietats intermèdies entre les protamines i les histones. La cristal·lització d'una molècula d'aquestes característiques aportaria informació sobre l'estructura de les proteïnes que participen en la compactació de la cromatina i podria obrir un nou camí per a la cristal·lització de les protamines i dels complexos NP-protamina.

Nucleoplasmin (NP) is the most abundant protein found in the nuclei of oocytes and nonfertilized eggs of "Xenopus laevis" and other amphibians. It is an acidic protein with three main acidic tracts (A1, A2, A3). NP is involved in the remodelation of chromatin during fecundation, facilitating nucleosome assembly as a molecular chaperone.<br/>In the present work we have continued the study of different recombinant forms of nucleoplasmin which were obtained in our lab, specially the form r-NP142 which has the main acidic tract A2 very exposed. We were interested in how different conditions could affect the stability and pentamerization of the molecule. In this way we studied the importance of Cys in NP pentamerization. We used site directed mutagenesis in order to change Cys for Ser. We observed that the mutation of Cys 45 favoured the monomerization of r-NP142, but this change didn't affect the oligomerization of the forms r-NP and r-NP121, which remained pentameric. These results suggest the absence of disulfide bridges in the pentameric structure of nucleoplasmin. The structural characterization of nucleoplasmin has been studied at different levels. At the secondary structure level we have used circular dichroism techniques and we have determined that the mutant r-NP142 C45S is in random coil conformation. For higher structural levels we have used electron microscopy and crystallographic techniques.<br/>Another objective of this work was the characterization of the interactions between NP and nucleosomal core histones. We were specially interested in knowing if the interaction was fundamentally electrostatic. Using analytical ultracentrifugation and sucrose gradient experiments we could determine that NP can bind the four types of nucleosomal histones. This binding would have an stoichiometry equal to 1 mol of NP pentamer per mol of histone octamer. It is important to note that NP can bind trypsinated histones (without the basic tails) maintaining the same stoichiometry as in the case of native histones. In the same way, the r-NP121 form (without the acidic tract A2) is capable of binding native histones with the same stoichiometry described for the other cases. These result indicates that the interaction NP-histones is not mainly electrostaticaly driven.<br/>Another objective of this work was the study of the presence of some NP-like proteins in oocyte extracts of the starfish "Echinaster sepositus". We have found a very abundant protein which is termoestable, acidic and partially resistant to ammonium sulphate. This protein is recognized by policlonal antinucleoplasmin antibodies which were obtained in hen eggs. However, it is not able to decondense spermatic nuclei which contain protamine.<br/>The last objective of the present work was the structural study of the protein ?0 which is specific of the nuclei of the echinoderm "Holothuria tubulosa" and has intermediate properties between histones and protamines. The crystallization of a molecule like ?0 could bring information about the structure of proteins that participate in chromatin condensation and could offer a new way for the crystallization of protamines and NP-protamine complexes.