A new vaccine strategy to combat viral infections in European-farmed finfish

Abstract

La indústria aqüícola és un sector en creixement dinàmic i una font d’aliment d’alta qualitat en un context de decreixement dels estocs d’espècies salvatges i de necessitat d’assolir una seguretat alimentaria global. Les malalties víriques són encara una gran amenaça per a la producció de peixos i manquen estratègies terapèutiques antivirals. Normalment, les vacunes disponibles al mercat són en format de virus inactivats i només es dirigeixen a unes poques espècies de peixos amb un alt valor comercial. D’altra banda el procés de producció i administració de vacunes és car ja que requereix una administració individualitzada per injecció. En aquest escenari el desenvolupament de noves vacunes, eficaces i pràctiques que siguin adequades per a la vacunació massiva és una prioritat per a la indústria. En aquesta tesi hem abordat el problema utilitzant nous biomaterials per buscar estratègies innovadores. Hem produït de forma nanostructurada proteïnes virals antigèniques com a cossos d’inclusió bacterians (CI), produïts en Escherichia coli. El principal atractiu dels CI com a vacunes per a l’aqüicultura, és que són barats, segurs i estables in vivo sense necessitat d’encapsulació, a diferència de les proteïnes recombinants solubles. Proporcionen un reservori de proteïnes biològicament actives que s'alliberen lentament. En aquesta tesi les hem produït de tres virus rellevants per l’aqüicultura europea: la soca emergent del virus de la necrosi nerviosa (VNNV, RGNNV/SJNNV) que afecta els peixos de conreu marins mediterranis i els virus de la necrosis pancreàtica viral (IPNV) i de la septicèmia hemorràgica viral (VHSV), els quals afecten a salmònids. Presentem una caracterització completa de la producció i la resposta immune a tres nanopartícules fetes de proteïnes virals antigèniques de cada un dels virus: la proteïna C del VNNV, la proteïna VP2 de la càpside del IPNV i un fragment de la glicoproteïna G del VHSV. Demostrem que les tres nanopartícules són internalitzades per les cèl·lules hepàtiques del peix zebra (ZFL) utilitzant citometria de flux i microscòpia confocal. Utilitzant qPCR, demostrem que les nanopartícules tenen propietats immunostimulants in vitro, evocant una resposta immunitària innata anti-viral tant en ZFL com en cultius primaris de macròfags de truita. També demostrem que el peix zebra pot internalitzar les nanopartícules a través de l’epiteli de l'intestí el que suposa una prova de concepte per l’administració oral de les vacunes. En cap cas es van observar efectes tòxics in vivo ni en els assajos de citotoxicitat in vitro. En dos models in vivo utilitzant llenguado senegalès (S. senegalensis) i truita irisada (O. mykiss), demostrem que les proteïnes virals nanoestructurades VNNV-CNP i VHSV-G-frg16NP, quan s'injecten per via intraperitoneal (i.p.), poden generar anticossos antivirals específics que ens indiquen que hem induït protecció. A més, mostrem que les IgMs anti-VHSV que es produeixen en truita tenen capacitat neutralitzant i que, després d’una infecció amb el virus, la supervivència dels peixos vacunats és coherent amb la protecció observada. Amb el llenguado senegalès es van realitzar també estudis d’expressió gènica i es va comparar la resposta d’anticossos després d’una administració i.p. i una administració oral utilitzant un nou mètode d’intubació. Els nostres resultats mostren que la via oral pot generar anticossos anti-virals, però ha de ser optimitzada per evitar una resposta de tolerància. Concloem que aquest nou enfoc per produir vacunes per espècies de peixos d’interès comercial desenvolupat en el marc d’aquesta tesis doctoral, mostra resultats molt prometedors.

The aquaculture industry is a sector of dynamic growth, providing a high quality food source in the context of diminishing wild fish stocks and the need for global food security. Viral diseases are a major threat to finfish production and therapeutics are still lacking. Typically, commercially available vaccines are in the format of inactivated virus and are targeted to only a few, high market value fish species. The production and delivery process is expensive, with individual administration via injection. In this scenario, developing new, effective, practical vaccines which could be suitable for mass vaccination is a priority in the industry. In this thesis we have drawn on recent work in biomaterials science to seek innovative strategies. We have nanostructured antigenic fish viral proteins as bacterial inclusion bodies (IBs), produced in Escherichia coli. The attractiveness of IBs as a vaccine design for aquaculture is that they are cheap, safe and stable in vivo without encapsulation, in contrast to soluble proteins. They provide a reservoir of biologically active protein which is slowly released. Here we target three viruses relevant in European finfish farming: The emergent reassortant strain of viral nervous necrosis virus (VNNV strain RGNNV/SJNNV) affecting Mediterranean marine farmed fish, and infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) and viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV), both affecting salmonids. We present a comprehensive study of the production and immune response to three protein nanoparticle IBs made of antigenic proteins from each virus, VNNV coat protein C, IPNV capsid protein VP2 and a VHSV glycoprotein G fragment. We demonstrate the three nanoparticles are taken up by zebrafish liver cells (ZFL) using flow cytometry and confocal microscopy. Using qPCR, we show the nanoparticles have immunostimulant properties in vitro, evoking an anti-viral innate immune response in ZFL and primary trout macrophage cultures. We also demonstrate by oral gavage that zebrafish can take up the nanoparticles through the intestine as a proof of concept for oral delivery. No toxic effects were observed in vivo nor in an MTT cytotoxicity assay in vitro. In in vivo farmed fish models using Senegalese sole (S. senegalensis) and rainbow trout (O. mykiss), we report the nanostructured viral proteins VNNV-CNP and VHSV-G-frg16NP, when injected intraperitoneally (i.p.), can raise specific, antiviral antibodies, as a surrogate of protection. Moreover, we show the anti-VHSV IgMs raised in trout are neutralizing, and upon infectious challenge with the virus, survival of vaccinated fish is consistent with protection. In Senegalese sole we also performed immune gene expression studies and compared the antibody response for i.p. and oral delivery using a novel oral intubation method. Our findings show the oral route can raise anti-viral antibodies but needs to be optimized to avoid a tolerance response. We conclude this new approach to develop practical vaccines for farmed fish holds promise.