Regulation of the mitotic exit in eukaryotic cells

Abstract

A cèl·lules eucariotes, la mitosi és la fase del cicle cel·lular en què segreguen els cromosomes replicats (anafase) i la cèl·lula es divideix físicament en dues cèl·lules filles durant la sortida de mitosi (citocinesi). Existeixen múltiples controls que operen per impedir la sortida de mitosi abans de la finalització de la segregació cromosòmica, esdeveniment que dona lloc a inestabilitat cromosòmica i aneuploïdia. Ambdues són condiciones que promouen la transformació maligna.

Un punto crític de control és l'exercit per l'activitat Quinasa Depenent de Ciclina Mitòtica (M-Cdk1). L'alliberament de la fosfatasa Cdc14 des del nuclèol al citosol, que contraresta les fosforilacions produïdes per l'activitat M-Cdk1, és essencial per disparar la sortida de mitosi. Les mutacions inactivadores de Cdc14 o d'elements de MEN (Mitotic Exit Network), responsable de l'alliberament controlat de Cdc14, atura les cèl·lules després d'anafase, incapaces de portar a terme la citocinesi. Això indica que un o més substrats de M-Cdk1/Cdc14 són essencials per impedir la sortida de mitosis prematura.

Basant-nos en l'organisme model eucariota Saccharomyces cerevisiae, hem ideat una aproximació experimental per identificar el conjunt mínim de substrats a través dels quals M-Cdk1 bloqueja la citocinesi prematura. Les cèl·lules que sobre-expressen un al·lel induïble hiperestable de la ciclina mitòtica clb2[Delta]N s'aturen després d'anafase, incapaces portar a terme la sortida de mitosi. Per tant, cèl·lules modificades portadores d'al·lels no fosforilables dels substrats crítics de M-Cdk1/Cdc14, haurien de ser capaces de procedir amb el programa de sortida de mitosi en presència continuada d'activitat M-Cdk1 elevada.

A aquesta tesi, mostrem que una soca que integra els al·lels no fosforilables de les quinases de MEN Cdc15 y Mob1-Dbf2, supera parcialment el control de l'activitat M-Cdk1, donat que les quinases localitzen prematurament als SPB (Spindle Pole Bodies), lloc d'activació de MEN. Malgrat superar aquest control, les cèl·lules sota presència continuada d'activitat M-Cdk1 elevada no aconsegueixen alliberar Cdc14 al citosol i no activen el programa de sortida de mitosi. Aquestes observacions apunten a l'existència com a mínim una diana crítica de M-Cdk1 addicional a la capçalera de la via MEN.

En las células eucariotas, la mitosis es la fase del ciclo celular en la que segregan los cromosomas replicados (anafase) y la célula se divide físicamente en dos células hijas durante la salida de mitosis (citocinesis). Existen múltiples controles que operan para impedir la salida de mitosis antes de la compleción de la segregación cromosómica, hecho que da lugar a inestabilidad cromosómica y aneuploidía. Ambas son condiciones que promueven la transformación maligna.

Un punto de control crítico es ejercido por la actividad Cinasa Dependiente de Ciclina Mitótica (M-Cdk1). La liberación de la fosfatasa Cdc14 del nucleolo al citosol, que contrarresta las fosforilaciones producidas por la actividad M-Cdk1, es esencial para disparar la salida de mitosis. Las mutaciones inactivadoras de Cdc14 o de elementos de MEN (Mitotic Exit Network), responsable de la liberación controlada de Cdc14, bloquea las células tras anafase, incapaces de llevar a cabo la citocinesis. Ello indica que uno o más sustratos de M-Cdk1/Cdc14 son esenciales para impedir la salida de mitosis prematura.

Basándonos en el organismo modelo eucariota Saccharomyces cerevisiae, hemos ideado una aproximación experimental para identificar el conjunto mínimo de sustratos a través de los cuales M-Cdk1 bloquea la citocinesis prematura. Las células que sobre-expresan un alelo inducible hiperestable de la ciclina mitótica clb2[Delta]N paran el ciclo tras la anafase, incapaces de llevar a cabo la salida de mitosis. Por tanto, células modificadas portadoras de alelos no fosforilables de los sustratos críticos de M-Cdk1/Cdc14, deberían ser capaces de proceder con el programa de salida de mitosis en presencia continuada de actividad M-Cdk1 elevada.

En esta tesis, mostramos que una cepa que integra los alelos no fosforilables de las cinasas de MEN Cdc15 y Mob1-Dbf2, supera parcialmente el control de la actividad M-Cdk1, dado que las cinasas localizan prematuramente en los SPB (Spindle Pole Bodies), lugar de activación de MEN. Pese a superar dicho control, las células bajo presencia continuada de actividad M-Cdk1 elevada, no logran liberar Cdc14 al citosol y no proceden con el programa de salida de mitosis. Estas observaciones apuntan a la existencia de por lo menos una diana crítica de M-Cdk1 adicional en la cabecera de la vía MEN.

In eukaryotic cells, mitosis is the cell cycle phase in which the replicated chromosomes are segregated (anaphase) and the cell is physically divided into two daughter cells at the mitotic exit (cytokinesis). Multiple controls operate to prevent the occurrence of mitotic exit before the completion of chromosome segregation, which would result in genomic instability and aneuploidy, conditions that fuel malignant transformation.

A critical control layer is enforced by the Mitotic Cyclin Dependent Kinase activity (M-Cdk1). The release from the nucleolus to the cytosol of the Cdc14 phosphatase, which counteracts M-Cdk1 phosphorylation activity, is essential to trigger mitotic exit. Null mutations in Cdc14 or in the Mitotic Exit Network (MEN), responsible for the controlled release of Cdc14, arrest cells after anaphase, unable to undergo cytokinesis. Therefore, one or more M-Cdk1/Cdc14 substrates are critical to block a premature mitotic exit.

Using the model eukaryotic organism Saccharomyces cerevisiae, we devised an experimental approach to identify the minimal set of substrates through which M-Cdk1 blocks premature cytokinesis. Cells over-expressing an inducible copy of the hyperstable mitotic cyclin clb2[Delta]N mutant permanently arrest after anaphase, unable to undergo mitotic exit. Therefore, cells carrying non-phosphorylatable alleles of the critical M-Cdk1/Cdc14 substrates should be able to enter mitotic exit in the presence of sustained high M-Cdl1 activity.

In this thesis, we show that a strain carrying non-phosphorylatable alleles of the MEN kinases Cdc15 and Mob1-Dbf2 partially overrides the control of M-Cdk1 activity, as the kinases localise prematurely to the Spindle Pole Bodies, the sites for MEN activation. Despite bypassing such control, cells under sustained high M-Cdk1 activity fail to release Cdc14 to the cytosol and mitotic exit does not occur. These observations point to at least an additional critical M-Cdk1 target upstream in the MEN pathway.