Unió seqüencial de múltiples dominis proteics in vivo i in vitro utilitzant trans-inteïnes ortogonals

Abstract

ENG- Inteins are a type of protein that can excise themselves from inside a precursor protein sequence, joining the two ends (named exteins) forming a mature protein. This process is termed protein splicing. One particular kind of inteins are trans-inteins, which are expressed in two different genes forming two protein precursors, each with one intein subunit fused to the corresponding extein. Although they are expressed separately, they can join afterwards and carry out the protein splicing reaction the same way, linking together the two exteins to form a single final protein.

Inteins are versatile biotechnological tools, and multiple applications have been developed to take advantage of their unique properties. One of such applications consists in taking advantage of the ability of trans-inteins of joining two exteins that are expressed independently to label each of these exteins differently and obtain a single mature protein with a fragment differentially labelled. This is useful to be able to express a fragment in the presence of 13C i 15N isotopes, which can allow for the study of the structure and molecular dynamics of that fragment via nuclear magnetic resonance. This is interesting in order to study the structure of specific domains in proteins of big size, such as TDP-43, a protein that’s related to pathologies like amiotrophic lateral sclerosis.

In this thesis we have studied four trans-inteins: gp41-1, gp41-8, IMPDH-1 and NrdJ-1. Initially, we evaluated their splicing activity and orthogonality: that is, studying if their subunits are specific to themselves and they don’t cross-react with one another. In fact, we have demonstrated that they indeed behave orthogonally and, additionally, confirmed they can carry out protein splicing quickly and efficiently.

Secondly, we designed a system using these inteins in which we can fuse up to four different protein fragments expressed independently. At the same time, we have studied the ability for these inteins to still carry out protein splicing even when modifying the protein sequences adjacent to them. We have been successful in demonstrating that, even thought the efficiency of the splicing reaction was affected when modifying these sequences, it is possible to obtain a complete protein from four independently expressed protein fragments using three orthogonal inteins with a good yield.

Finally, we used this intein system to obtain a full-length TDP-43 protein from four of its independent domains. In this case, only three of the domains were successfully fused, so further efforts should be conducted to optimize the system described in this thesis.

Altogether, this work poses a progress in the use and understanding of inteins as biotechnological tools, in addition to offering new and relevant information in the limitations of the four inteins of this study

CAT- Les inteïnes són un tipus de proteïnes que poden escindir-se de l’interior d’una proteïna precursora, unint els dos extrems (anomenats exteïnes) per formar una proteïna madura. Aquest procés s’anomena splicing, o tall i unió de proteïnes. Dins de les inteïnes hi podem destacar les inteïnes partides, les quals s’expressen en dos gens diferents formant dos precursors proteics, cadascun amb una subunitat de la inteïna i la seva exteïna corresponent. Tot i expressar-se com a dues proteïnes independents, aquest tipus d’inteïnes poden unir-se després d’haver-se expressat i dur a terme la reacció d’splicing de la mateixa forma, unint així les dues exteïnes per formar una única proteïna final.

Les inteïnes són eines biotecnològiques molt versàtils i s’han desenvolupat múltiples aplicacions per aprofitar les seves propietats úniques. Una d’aquestes aplicacions consisteix en aprofitar la capacitat de les inteïnes partides d’unir exteïnes expressades independentment per poder produir cada exteïna en condicions diferents, i d’aquesta manera obtenir una proteïna madura amb fragments marcats de forma diferencial. Una utilitat d’aquest mètodes és marcar un fragment expressant-lo en presència d’isòtops de 13C i 15N per estudiar l’estructura i la dinàmica molecular del fragment marcat per ressonància magnètica nuclear. Això és interessant per estudiar l’estructura de dominis concrets de proteïnes de gran mida, com el cas de la proteïna TDP-43, relacionada amb patologies com l’esclerosi lateral amiotròfica.

En aquesta tesi hem estudiat quatre inteïnes partides: gp41-1, gp41-8, IMPDH-1 i NrdJ-1. Inicialment, hem avaluat la seva activitat d’splicing i la seva ortogonalitat: això és, estudiar si les subunitats aquestes inteïnes partides són específiques per a elles mateixes i no reaccionen de forma creuada. Hem demostrat que aquestes inteïnes es comporten de forma ortogonal i a més a més s’ha confirmat que poden dur a terme la unió d’exteïnes de forma ràpida i eficient.

En segon lloc, hem dissenyat un sistema d’unió de quatre fragments de proteïna utilitzant aquestes inteïnes. Alhora, s’ha estudiat la capacitat d’aquestes inteïnes de dur a terme la reacció d’splicing i unir aquests fragments modificant la seqüència proteica que es troba adjacent a la seqüència de la inteïna. Hem aconseguit demostrar que, malgrat una disminució en l’eficiència de la reacció en modificar les seqüències adjacents, es pot obtenir una proteïna completa a partir de quatre fragments expressats independentment mitjançant tres inteïnes ortogonals amb un bon rendiment.

Finalment, hem utilitzat el sistema establert per a obtenir la proteïna TDP-43 completa a partir de quatre dels seus dominis independents. En aquest cas, només s’han aconseguit fusionar tres dels dominis i, per tant, cal treballar en una optimització del sistema descrit en aquesta tesi.

En conclusió, aquest treball suposa un progrés en la utilització d’inteïnes com a eines biotecnològiques, a més a més de proporcionar informació molt rellevant sobre les limitacions de les quatre inteïnes estudiades