Allosteric modulation of mutant rhodopsins folding and function as a new therapeutic strategy for the treatment of retinitis pigmentosa

Abstract

(English) G protein-coupled receptors (GPCRs) are the largest family of membrane proteins in mammals and are essential for sensing external signals and regulating intracellular signaling pathways. Among GPCRs, rhodopsin plays a critical role in phototransduction in retinal rod cells, and its structural and functional integrity is vital for vision. Mutations in the opsin gene are closely associated with inherited retinal diseases such as retinitis pigmentosa (RP), characterized by progressive photoreceptor degeneration and eventual blindness. Despite limited therapeutic options for RP, emerging strategies focusing on protein stabilization and allosteric modulation offer new hope. This study systematically explored the effects of trace metal ions and small molecules on rhodopsin stability, chromophore regeneration dynamics, and signaling properties. We found that Fe³⁺ significantly enhances the thermal and chemical stability of both wild-type (WT) and G90D mutant, while Fe²⁺ exhibited no protective effects and Cu²⁺ strongly destabilized rhodopsin and impaired its regeneration. These findings highlight the critical role of metal ion homeostasis in maintaining rhodopsin function and suggest that modulating iron oxidation states could be a therapeutic strategy for retinal degenerative diseases. Analysis of RP-associated G90D and G90V mutants revealed that while both mutations caused a blue shift in the absorption maximum, G90V exhibited markedly reduced thermal stability, impaired photobleaching response, delayed retinal release, and severely disrupted chromophore regeneration, whereas G90D showed less altered structural and functional characteristics. Although Fe³⁺ provided some stabilization to G90D, it was less effective than in WT rhodopsin, likely due to mutation-induced conformational changes. Retigabine significantly enhanced the thermal stability of rhodopsin and promoted efficient chromophore regeneration, indicating its potential as a pharmacological chaperone for stabilizing rhodopsin mutants implicated in retinal degenerative diseases. Retigabine bound rhodopsin without disrupting photobleaching kinetics or G-protein activation, likely binding to an allosteric site to stabilize protein conformation while preserving normal phototransduction. These properties highlight retigabine potential as a therapeutic strategy for retinal degeneration. Moreover, the study analyzed the F88L mutation, revealing that F88L rhodopsin maintains normal spectral properties and visual function but exhibits enhanced thermal stability and accelerated MII decay. Hydroxylamine unexpectedly stabilized the MI intermediate in F88L, indicating a novel regulatory aspect of rhodopsin photocycle. These results suggest that amino acid at position 88 may be involved in rhodopsin molecular evolution and in light adaptation in nocturnal vision. In addition, the small molecule C24 was found to modulate F88L rhodopsin by enhancing chromophore regeneration and accelerating MII decay, indicating potential strategies for fine-tuning rhodopsin dynamics. Overall, these findings provide important insights into the stabilization mechanisms of rhodopsin and lay a foundation for developing novel therapies targeting retinal degenerative diseases through metal ion regulation and small-molecule modulation.

(Català) Els receptors acoblats a proteïnes G (GPCR) constitueixen la família més gran de proteïnes de membrana en mamífers i són essencials per detectar senyals externs i regular les vies de senyalització intracel·lular. Entre ells, la rodopsina té un paper clau en la fototransducció a les cèl·lules bastó de la retina, i la seva integritat estructural i funcional és vital per a la visió. Les mutacions en el gen de la rodopsina estan estretament relacionades amb malalties hereditàries de la retina, com la retinosi pigmentària (RP), caracteritzada per la degeneració progressiva dels fotoreceptors i eventual ceguesa. Aquest estudi explora sistemàticament els efectes dels metalls essencials i petites molècules sobre l'estabilitat de la rodopsina, la dinàmica de regeneració del cromòfor i les seves propietats funcionals. Hem observat que el Fe³⁺ millora significativament l’estabilitat tèrmica i química de la rodopsina salvatge (WT) i del mutant G90D, mentre que el Fe²⁺ no ofereix cap protecció i el Cu²⁺ desestabilitza fortament la proteïna i n’impedeix la regeneració. Això subratlla la importància de la homeòstasi dels metalls en la retina i suggereix que modular els estats d’oxidació del ferro podria tenir un valor terapèutic en el tractament de malalties de la retina. L’anàlisi dels mutants G90D i G90V associats a RP va mostrar un desplaçament cap al blau en l’espectre d’absorció. El G90V presenta una estabilitat tèrmica reduïda, una resposta alterada a la il·luminació, una alliberació de retinal més lenta i una regeneració severament deteriorada, mentre que el G90D conserva característiques menys alterades. Tot i que el Fe³⁺ aporta certa estabilització al G90D, és menys eficaç que pel WT, probablement per canvis conformacionals induïts per la mutació. La retigabina augmenta notablement l’estabilitat tèrmica i la regeneració del cromòfor, actuant com una chaperona farmacològica sense alterar la fototransducció, fet que apunta al seu potencial terapèutic. Probablement actua en un lloc al·lostèric, estabilitzant la conformació de la proteïna. A més, el mutant F88L mostra propietats espectrals i funcionals normals, però amb una estabilitat tèrmica millorada i un decaïment accelerat de l’estat Metarodopsina II (MII). Curiosament, l’hidroxilamina estabilitza l’estat Metarodopsina I en F88L, suggerint un nou mecanisme regulador del cicle fotoquímic. Aquests resultats suggereixen que l’aminoàcid en la posición 88 podria estar implicat en l’evolució molecular de la rodopsina i en l’adaptacio a la llum en la visió nocturna. Per altra banda, la molècula C24 afavoreix la regeneració del cromòfor i accelera el decaïment de l’estat MII, oferint noves estratègies per modular la dinàmica de la rodopsina. En conjunt, aquests resultats aporten nous coneixements sobre els mecanismes d’estabilització de la rodopsina i estableixen una base per al desenvolupament de noves teràpies per a malalties degeneratives de la retina mitjançant la regulació de metalls i la modulació amb petites molècules.

(Español) Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) constituyen la mayor familia de proteínas de membrana en mamíferos y son esenciales para detectar señales externas y regular vías de señalización intracelular. Entre ellos, la rodopsina desempeña un papel clave en la fototransducción en los bastones retinianos, y su integridad estructural y funcional es fundamental para la visión. Las mutaciones en el gen de la rodopsina están estrechamente relacionadas con enfermedades hereditarias de la retina, como la retinosis pigmentaria (RP), caracterizada por degeneración progresiva de las células fotorreceptoras y ceguera. Este estudio explora sistemáticamente los efectos de iones metálicos esenciales y pequeñas moléculas sobre la estabilidad de la rodopsina, la dinámica de regeneración del cromóforo y sus propiedades funcionales. Se observó que Fe³⁺ mejora significativamente la estabilidad térmica y química de la rodopsina tipo salvaje (WT) y del mutante G90D, mientras que Fe²⁺ no ofrece protección y Cu²⁺ desestabiliza fuertemente la proteína e impide su regeneración. Esto subraya la importancia de la homeostasis de estos iones metálicos en la retina y sugiere que modular los estados de oxidación del hierro podría ser una estrategia terapéutica para el tratamiento de enfermedades de la retina. El análisis de los mutantes G90D y G90V asociados a RP mostró que ambos presentan un desplazamiento hacia el azul en el espectro de absorción. Sin embargo, G90V tiene una estabilidad térmica muy reducida, respuesta a la iluminación alterada, liberación de retinal retardada y regeneración del cromóforo severamente afectada, mientras que G90D conserva características menos alteradas. Aunque Fe³⁺ estabiliza parcialmente G90D, su eficacia es menor que en WT, posiblemente por cambios conformacionales inducidos por la mutación. La retigabina mejora notablemente la estabilidad térmica y la regeneración del cromóforo, actuando como chaperona farmacológica sin alterar la fototransducción, lo que indica su potencial terapéutico. Se presume que actúa en un sitio alostérico, estabilizando la conformación de la proteína. Además, el mutante F88L mostró propiedades espectrales y funcionales normales, pero con mayor estabilidad térmica y un decaimiento acelerado del estado Metarrodopsina II (MII). La hidroxilamina estabilizó de forma inesperada el estado Metarrodopsina I en F88L, revelando un nuevo aspecto regulador del ciclo fotoquímico. Estos resultados sugieren que el aminoácido en la posición 88 podría estar implicado en la evolución molecular de la rodopsina y en la adaptación a la luz en la visión nocturna. Por otro lado, la molécula C24 mejoró la regeneración del cromóforo y aceleró el decaimiento del estado MII en F88L, lo que sugiere nuevas vías para modular la dinámica conformacional de la rodopsina. En conjunto, estos hallazgos ofrecen nuevas perspectivas sobre los mecanismos de estabilización de la rodopsina y sientan las bases para terapias innovadoras contra enfermedades degenerativas de la retina mediante regulación por metales e intervención con pequeñas moléculas.