Development and optimization of Reconstructed Human Epidermal Models for dermatological and cosmetic research

Abstract

Els models d’epidermis humana reconstruïda (RHE, per les seves sigles en anglès) són sistemes complexos tridimensionals (3D) in vitro que reprodueixen les característiques estructurals i funcionals de la pell humana nativa. Els RHE han estat àmpliament utilitzats en recerca dermatològica, toxicologia i proves cosmètiques, oferint una alternativa validada científicament a l’experimentació amb animals. Tot i això, encara hi ha aspectes d’aquests models que poden ser millorats, com ara l’eliminació completa dels components d’origen animal. Un altre avanç important dins aquesta categoria ha estat la generació dels models d’epidermis humana pigmentada reconstruïda (RHPE), els quals incorporen melanòcits humans a l’arquitectura epidèrmica. Els RHPE són especialment útils per estudiar els mecanismes de pigmentació de la pell humana, trastorns de pigmentació, o per avaluar agents cosmètics blanquejants o bronzejadors.

Al primer capítol d’aquesta tesi, vam comparar suplements químicament definits i lliures d’origen animal (cdAOF) amb el suplement àmpliament utilitzat d’origen animal “human keratinocyte growth supplement” (HKGS), que conté extracte de pituïtària i factors de creixement d’origen boví. Presentem aquí una caracterització de RHE cultivats amb queratinòcits de nounat, adult i immortalitzats N/TERT en condicions cdAOF. Els nostres resultats indiquen que els suplements sense components animals donen suport de manera efectiva a la producció de RHE amb aquests tipus cel·lulars. L’anàlisi morfològica va revelar que tots els RHE es van desenvolupar en una epidermis totalment diferenciada amb una localització fisiològica dels marcadors epidèrmics clau, incloent queratina 14, queratina 10, loricrina i filagrina, tal com es va estudiar mitjançant immunotinció. No obstant això, els queratinòcits basals en models reconstruïts amb cèl·lules primàries i suplements sense components animals van mostrar una forma cel·lular menys cilíndrica i una expressió reduïda d’involucrina en comparació amb els RHE obtinguts amb HKGS. A més, es va observar una alteració en la proliferació de queratinòcits, una disminució en la funció barrera, i una elevació dels nivells de marcadors proinflamatoris mitjançant RT-qPCR.

En conclusió, els resultats mostren que la reconstrucció de RHE es pot aconseguir en condicions de cultiu cdAOF, tot mantenint característiques epidèrmiques i fisiològiques clau. Amb ajustaments addicionals, aquest model té potencial per a aplicacions més àmplies en medicina regenerativa, proves cosmètiques in vitro i recerca dermatològica.

Per ampliar l’aplicació de l’epidermis reconstruïda en la recerca de pigmentació, al segon capítol vam optimitzar les condicions de cultiu del model RHPE. En segon lloc, vam introduir un mètode basat en aprenentatge automàtic mitjançant el programari ilastik per a la quantificació de melanina dins dels RHPE. A continuació, vam utilitzar el nostre model RHPE per avaluar el potencial despigmentant de l’extracte de rizoma d’Atractylodes lancea (Thunb.) DC. (ALRE). A partir de la plataforma RHPE, vam desenvolupar un nou model in vitro de dermatits atòpica (DA) estimulant els RHPE amb un còctel d’interleucines (IL-4, IL-13 i IL-31) durant un període de temps. El model resultant, RHPE-DA, va mostrar característiques pròpies de la DA, incloent una morfologia alterada dels queratinòcits, sobreexpressió del biomarcador CA2 i d’altres marcadors inflamatoris, així com una melanogènesi alterada. Macroscòpicament, el teixit va presentar àrees hipopigmentades similars a les observades en la Pityriasis Alba (PA), un trastorn pigmentari comú però poc entès, associat a la DA. L’anàlisi mitjançant microscòpia electrònica de transmissió (TEM) va revelar una distribució alterada dels grànuls de melanina entre melanòcits i queratinòcits, suggerint que la inflamació induïda per la DA interfereix en la distribució de la melanina, provocant la despigmentació visible.

Los modelos de epidermis humana reconstruida (RHE, por sus siglas en inglés) son sistemas tridimensionales (3D) complejos in vitro que reproducen las características estructurales y funcionales de la piel humana nativa. Los RHE se han utilizado ampliamente en la investigación dermatológica, la toxicología y los ensayos cosméticos, proporcionando una alternativa científicamente validada a la experimentación con animales. Sin embargo, todavía existen aspectos de estos modelos que pueden mejorarse, como la eliminación completa de componentes de origen animal. Otro avance importante en esta categoría ha sido la generación de modelos de epidermis humana pigmentada reconstruida (RHPE), que incorporan melanocitos humanos en la arquitectura epidérmica. Los RHPE son especialmente valiosos para estudiar los mecanismos de pigmentación de la piel humana, los trastornos pigmentarios o para probar agentes cosméticos despigmentantes o bronceadores.

En el primer capítulo de esta tesis, comparamos suplementos definidos químicamente y libres de componentes de origen animal (cdAOF) con el suplemento de uso común derivado de animales, el suplemento de crecimiento de queratinocitos humanos (HKGS), que contiene extracto de hipófisis y factores de crecimiento de origen bovino. Presentamos aquí una caracterización de RHE cultivados con queratinocitos neonatales, adultos e inmortalizados N/TERT bajo condiciones cdAOF. Nuestros resultados indican que los suplementos libres de origen animal apoyan eficazmente la producción de RHE en todos estos tipos celulares. El análisis morfológico reveló que todos los RHE se desarrollaron en una epidermis completamente diferenciada con localización fisiológica de marcadores epidérmicos clave, incluidos la queratina 14, queratina 10, loricrina y filagrina, según se estudió mediante inmunomarcaje. Sin embargo, los queratinocitos basales en modelos reconstruidos con células primarias y suplementos libres de origen animal presentaron una morfología menos cilíndrica y una menor expresión de involucrina en comparación con los RHE generados con HKGS. Además, la proliferación de queratinocitos se vio alterada, la función barrera disminuyó y la RT-qPCR reveló niveles elevados de marcadores proinflamatorios en los RHE reconstruidos con suplementos libres de origen animal.

En conclusión, los resultados muestran que es posible reconstruir la epidermis humana en condiciones de cultivo cdAOF, conservando características epidérmicas y fisiológicas clave. Con mejoras adicionales, este modelo tiene un gran potencial para aplicaciones más amplias, que van más allá de la medicina regenerativa, incluyendo ensayos cosméticos in vitro y estudios dermatológicos.

Para ampliar la aplicación de la epidermis reconstruida en la investigación de la pigmentación, en el segundo capítulo optimizamos las condiciones de cultivo en el modelo de Epidermis Humana Pigmentada Reconstruida (RHPE). En segundo lugar, introdujimos un método basado en aprendizaje automático mediante el software ilastik para la cuantificación de melanina en los modelos RHPE. Luego, utilizamos nuestro modelo RHPE para evaluar el potencial despigmentante de un extracto de rizoma de Atractylodes lancea (Thunb.) DC. (ALRE). Basándonos en la plataforma RHPE, desarrollamos un nuevo modelo in vitro de dermatitis atópica (DA) estimulando RHPE con un cóctel de interleucinas (IL-4, IL-13 e IL-31) durante un periodo de tiempo. El modelo resultante, RHPE-DA, mostró características típicas de la DA, incluyendo una morfología alterada de los queratinocitos, sobreexpresión del biomarcador CA2 así como de marcadores inflamatorios, y melanogénesis alterada. A nivel macroscópico, el tejido presentó áreas hipopigmentadas que recuerdan a la Pitiriasis Alba (PA), un trastorno pigmentario común pero poco comprendido, asociado a la DA. La microscopía electrónica de transmisión (TEM) reveló una distribución alterada de los gránulos de melanina entre melanocitos y queratinocitos, lo que sugiere que la inflamación inducida por la DA interfiere en la distribución de la melanina, provocando despigmentación visible.

Reconstructed Human Epidermis (RHE) models are complex three-dimensional (3D) in vitro systems that recapitulate the structural and functional features of native human skin. RHEs have been widely employed in dermatological research, toxicology, and cosmetic testing, providing a scientifically validated alternative to animal experimentation. However, there are still aspects of these models that may be improved, such as the complete elimination of animal-derived components. Another important advancement within this category was the generation of Reconstructed Human Pigmented Epidermis (RHPE) models, which incorporate human melanocytes into the epidermal architecture. RHPEs are particularly valuable for studying pigmentary mechanisms in human skin, pigmentation disorders, or testing cosmetic whitening or tanning agents. In the first chapter of this Thesis, we compared chemically defined animal origin-free (cdAOF) supplements to the widely utilized animal-derived supplement human keratinocyte growth supplement (HKGS), containing pituitary extract and growth factors of bovine origin. Herein, we present a characterization of RHE grown with newborn, adult, and immortalized N/TERT keratinocytes under cdAOF conditions. Our results indicate that animal-free supplements effectively support RHE production across these cell types. Morphological analysis revealed that every RHE developed into a fully differentiated epidermis with a physiological localization of key epidermal markers, including keratin 14, keratin 10, loricrin, and filaggrin, as studied by immunolabeling. However, basal keratinocytes in models reconstructed with primary cells and animal-free supplements exhibited less cylindrical cell shape, and involucrin was expressed lower in the epidermis compared to HKGS-derived RHEs. Moreover, keratinocyte proliferation was altered, barrier function was decreased, and RT-qPCR revealed elevated levels of proinflammatory markers in RHE reconstructed with animal-free supplements. In conclusion, the results show that RHE reconstruction was achieved under cdOF culture conditions, preserving key epidermal and physiological features. With further refinement, this model holds potential for broader applications beyond regenerative medicine, including in vitro cosmetic testing and dermatological research. To broaden the application of reconstructed epidermis in pigmentation research, in the second chapter, we optimized culture conditions in the Reconstructed Human Pigmented Epidermis (RHPE) model. Secondly, we introduced a method based on machine learning using ilastik software for melanin quantification within RHPE. Next, our RHPE model was used to assess the depigmenting potential of a Atractylodes lancea (Thunb.) DC. rhizome extract (ALRE). Building upon the RHPE platform, we developed a novel in vitro AD model by stimulating RHPE with a cocktail of interleukins (IL-4, IL-13, and IL-31) over time. The resulting RHPE-AD model exhibited hallmark AD features, including impaired keratinocyte morphology, upregulation of the AD biomarker CA2 as well as inflammatory markers, and altered melanogenesis. Macroscopically, the tissue displayed hypopigmented areas reminiscent of Pityriasis Alba (PA), a common but poorly understood pigmentary disorder associated with AD. Transmission electron microscopy (TEM) revealed an altered distribution of melanin granules between melanocytes and keratinocytes, suggesting that AD-driven inflammation impairs melanin distribution, leading to visible depigmentation. In summary, in this Thesis, we optimized the protocol for generating RHPEs models, which can be used to study mechanisms associated with melanin and to assess the effects of prospective cosmetic ingredients. Furthermore, machine learning-based melanin quantification method proved to be a valuable alternative for chemical melanin extraction. Importantly, the RHPE model stimulated with inflammatory cytokines reproduces epidermal alterations seen in AD and pigmentation disturbances observed in PA patients. The in-depth characterization of this model offers novel insights into the pathology of PA, particularly by describing the inflammation-induced disruption of melanin distribution at the macroscopic and ultrastructural levels. In this context, the RHPE-AD model emerges as a promising new tool for investigating hypopigmentation mechanisms in inflammatory skin conditions and provides a physiologically relevant platform for pharmaceutical and cosmetic screening.