Exploring the molecular link between Alzheimer’s disease and the endocannabinoid system

Abstract

La malaltia d’Alzheimer (MA) és un trastorn neurodegeneratiu complex i progressiu caracteritzat per símptomes cognitius i neuropsiquiàtrics (SNP), juntament amb anormalitats moleculars com plaques β-amiloide (βA), cabdells neurofibril·lars, neuroinflamació i alteracions metabòliques. Tot i els avenços en la seva comprensió, els tractaments per prevenir o modificar-ne la progressió són limitats. Recentment, s’ha identificat el sistema endocannabinoide (SEC) com una teràpia prometedora pels seus efectes neuromoduladors en processos patològics de la MA, com l’excitotoxicitat, l’estrès oxidatiu i la neuroinflamació. Tanmateix, el vincle molecular entre la MA i el SEC encara no es comprèn del tot. Aquesta tesi va avaluar els efectes a llarg termini d’una activació crònica del receptor cannabinoide tipus 1 (CB1R) en el model murí APP/PS1 mitjançant arachidonil-2′-cloroetilamida (ACEA) durant l’etapa presimptomàtica. L’objectiu era investigar el paper del SEC en la progressió de la MA, amb èmfasi en alteracions conductuals i moleculars considerant el sexe, la regió cerebral i el tipus cel·lular. Es va caracteritzar el fenotip conductual i el SEC en ratolins APP/PS1 mascles i femelles de 3-4 mesos, confirmant aquesta fase com a presimptomàtica i adequada per a una intervenció primerenca amb ACEA. També es va evidenciar disfunció del SEC, amb alteracions específiques segons el sexe i la regió cerebral en l’expressió de CB1R, CB2R i enzims, suggerint la seva contribució a l’inici de la malaltia o potencial com a biomarcadors precoços. Tot seguit, es van analitzar els efectes a llarg termini del tractament presimptomàtic amb ACEA en ratolins de 12 mesos i es va observar un clar dimorfisme sexual. Els mascles van presentar dèficits de memòria de reconeixement i conductes depressives, mentre que les femelles van mantenir la funció cognitiva. Ambdós sexes van mostrar conductes compulsives des dels 6 mesos, reflectint símptomes tipus SNP. El tractament amb ACEA va prevenir alguns dèficits en mascles, donant suport al potencial terapèutic dels cannabinoides. A nivell molecular, les femelles van mostrar una càrrega més elevada de βA que els mascles en diverses regions cerebrals. El tractament amb ACEA va reduir aquesta càrrega només en femelles, especialment en regions corticals i motores i en plaques difuses i neurítiques, indicant un efecte terapèutic dependent del sexe. Quant als receptors cannabinoides, l’expressió de CB2R va augmentar a l’hipocamp (HPC) de les femelles als 12 mesos, possiblement reflectint un estat inflamatori, mentre que CB1R no va canviar a nivell d’ARN. No obstant això, ACEA va incrementar els nivells de proteïna CB1R al còrtex anterior i a l’HPC dels mascles. A més, en femelles es va observar una correlació inversa entre l’expressió de CB1R i les plaques βA, suggerint un possible paper neuroprotector. L’anàlisi metabolòmic dirigit va revelar alteracions específiques per sexe i regió cerebral en lípids relacionats amb el SEC, esteroides, intermediaris del cicle de Krebs i neurotransmissors. ACEA va corregir diverses d’aquestes alteracions, augmentant lípids neuroprotectors com el DHEA, millorant la funció mitocondrial i restaurant vies dopaminèrgiques i serotoninèrgiques, reforçant el valor terapèutic d’aquest enfocament. Les correlacions conductuals també van indicar interaccions complexes dependents del sexe entre el SEC i aquests metabòlits en la cognició i els SNP. Finalment, l’anàlisi de l’expressió gènica astrocitària mitjançant separació magnètica (MACS) va revelar alteracions en gens del metabolisme lipídic i redox. Catalasa, CPT1A i SFRP1A es van veure alterats en astròcits de mascles APP/PS1, indicant una participació astrogliar específica en la MA. ACEA va augmentar l’expressió de Gcl en astrocits d’ambdós sexes, donant suport a un efecte antioxidant mediat pel SEC. En conjunt, els resultats donen suport al potencial terapèutic de la modulació primerenca del SEC i destaquen la importància d’enfocaments específics segons sexe, regió cerebral i tipus cel·lular per comprendre i tractar millor la MA.

La enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno neurodegenerativo complejo y progresivo caracterizado por síntomas cognitivos y neuropsiquiátricos (SNP), junto con anormalidades moleculares como placas β-amiloide (βA), ovillos neurofibrilares, neuroinflamación y alteraciones metabólicas. Aunque se han logrado avances en su comprensión, los tratamientos para prevenir o modificar su progresión siguen siendo limitados. Recientemente se ha identificado al sistema endocannabinoide (SEC) como terapia prometedora por sus efectos neuromoduladores en procesos patológicos de la EA, como la excitotoxicidad, el estrés oxidativo y la neuroinflamación. Sin embargo, el vínculo molecular entre la EA y el SEC aún no se comprende del todo. Esta tesis evaluó los efectos a largo plazo de una activación crónica del receptor cannabinoide tipo 1 (CB1R) en el modelo murino APP/PS1 utilizando araquidonil-2′-cloroetilamida (ACEA) durante la etapa presintomática. El objetivo fue investigar el papel del SEC en la progresión de la EA, con énfasis en alteraciones conductuales y moleculares considerando el sexo, región cerebral y tipo celular. Se caracterizó el fenotipo conductual y el SEC en ratones APP/PS1 machos y hembras de 3-4 meses, confirmando esta fase como presintomática y adecuada para una intervención temprana con ACEA. A esa edad se evidenció disfunción del SEC, con alteraciones específicas por sexo y región cerebral en la expresión de CB1R, CB2R y enzimas, lo que sugiere que podrían contribuir al inicio de la enfermedad o actuar como biomarcadores precoces. A continuación, se analizaron los efectos a largo plazo del tratamiento presintomático con ACEA en ratones de 12 meses y se observó un claro dimorfismo sexual. Los machos presentaron déficits de memoria de reconocimiento y conductas depresivas, mientras que las hembras mantuvieron la función cognitiva. Ambos sexos mostraron conductas compulsivas desde los 6 meses, posiblemente reflejando síntomas tipo SNP. El tratamiento con ACEA previno algunos déficits en machos, respaldando el potencial terapéutico de intervenciones cannabinoides tempranas. A nivel molecular, las hembras mostraron mayor carga de βA que los machos en varias regiones cerebrales. El tratamiento con ACEA redujo dicha carga únicamente en hembras, especialmente en regiones corticales y motoras, y en placas difusas y neuríticas, indicando un efecto terapéutico dependiente del sexo. En cuanto a los receptores cannabinoides, la expresión de CB2R aumentó en el hipocampo (HPC) de hembras a los 12 meses, posiblemente reflejando un estado inflamatorio, mientras que CB1R no presentó cambios a nivel de ARN. No obstante, ACEA incrementó los niveles de proteína CB1R en corteza anterior e HPC de machos. Además, en hembras se observó una correlación inversa entre la expresión de CB1R y la carga de placas βA, lo que sugiere un posible rol neuroprotector. Además, el análisis metabolómico dirigido reveló alteraciones específicas por sexo y región en lípidos relacionados con el SEC, esteroides, intermediarios del ciclo de Krebs y neurotransmisores. ACEA corrigió varias de estas alteraciones, aumentando lípidos neuroprotectores como DHEA, mejorando la función mitocondrial y restaurando vías dopaminérgicas y serotoninérgicas, lo que refuerza el valor terapéutico de este enfoque. Las correlaciones conductuales también indicaron interacciones complejas dependientes del sexo entre el SEC y estos metabolitos en la cognición y los SNP. Finalmente, el análisis de expresión génica astrocitaria mediante separación magnética (MACS) reveló alteraciones en genes de metabolismo lipídico y redox. Catalasa, CPT1A y SFRP1A se vieron alterados en astrocitos de machos APP/PS1, indicando participación astrogliar específica en la EA. ACEA aumentó la expresión de Gcl en astrocitos de ambos sexos, apoyando un efecto antioxidante mediado por el SEC. En conjunto, los hallazgos respaldan el potencial terapéutico de la modulación temprana del SEC y destacan la importancia de enfoques específicos según sexo, región cerebral y tipo celular para comprender y tratar mejor la EA.

Alzheimer’s disease (AD) is a complex and progressive neurodegenerative disorder characterized by behavioural alterations such as cognitive and neuropsychiatric symptoms (NPS) and molecular abnormalities including β-amyloid (βA) plaques, neurofibrillary tangles, neuroinflammation and metabolic alterations. Despite substantial progress in understanding these pathological hallmarks, effective treatments to prevent or modify disease progression are scarce. Emerging evidence has identified the endocannabinoid system (ECS) as a promising therapeutic target for its range of neuromodulatory effects implicated in AD, such as excitotoxicity, oxidative stress, and neuroinflammation. However, the specific molecular link between AD and the ECS remains poorly understood. Accordingly, this thesis aimed to evaluate the long-term effects of an early cannabinoid-based intervention via chronic cannabinoid receptor 1 (CB1R) activation using arachidonyl-2′chloroethylamide (ACEA) during a presymptomatic stage using the APP/PS1 mouse model. This allowed us to further investigate the role of the ECS in AD pathology, with especial focus on behavioural and molecular deficits considering sex-, brain-region- and cell-type specific mechanisms. We first characterized behavioural performance and the ECS in male and female APP/PS1 mice at 3-4 months of age, confirming this stage as a presymptomatic behavioural stage suitable for early therapeutic interventions like ACEA treatment. In addition, ECS dysregulation was already present at 3 months, with sex- and brain region-specific alterations in CB1R and CB2R expression and enzyme levels, suggesting that ECS dysfunction may be an early contributor to AD progression or a potential early biomarker. We then examined the long-term effects of presymptomatic ACEA treatment in male and female APP/PS1 mice at 12 months, finding a clear sexual dimorphism: male APP/PS1 mice showed recognition memory deficits and depressive-like behaviour, while females maintained cognitive function. Moreover, both sexes displayed compulsive-like behaviours from 6 months onwards, possibly reflecting NPS-like features. Notably, ACEA treatment prevented certain behavioural deficits in male APP/PS1 mice, supporting the potential of early cannabinoid-based interventions in AD. At the molecular level, female APP/PS1 mice exhibited greater βA burden than male mice in multiple brain regions and ACEA treatment reduced βA plaque load only in females, particularly in cortical and motor-related regions and selectively targeting diffuse and neuritic plaques, indicating a sex-dependent therapeutic effect. When analysing cannabinoid receptors, CB2R gene expression was upregulated in the hippocampus (HPC) of female APP/PS1 mice at 12 months, likely reflecting an inflammatory state, whereas CB1R expression remained unchanged at the transcript level in both sexes. However, ACEA treatment mainly increased CB1R protein levels in the anterior cortex and HPC of male APP/PS1 mice. Moreover, an inverse correlation between CB1R expression and βA plaque burden was observed in female APP/PS1 mice, further supporting a neuroprotective role for CB1R. Targeted metabolomics revealed broad sex- and region-specific alterations in ECS-related lipids, steroids, TCA cycle intermediates, and neurotransmitters. ACEA treatment improved several of these alterations in a sex- and brain region-specific manner, increasing neuroprotective lipids like DHEA, supporting mitochondrial function by altering TCA intermediates and restoring dopamine and 5-HT pathways, further supporting the broad therapeutic potential of cannabinoid-based interventions in AD. Behavioural correlations further suggested that ECS and these metabolites interact in complex, sex-dependent ways to influence cognitive functions and NPS in AD-like disease. Finally, astrocyte-specific gene expression analysis using magnetic-activated cell sorting (MACS) revealed sex-dependent alterations in redox and lipid metabolism genes. Catalase, CPT1A and SFRP1A were specifically affected in the astrocyte-enriched fraction of male APP/PS1 mice, suggesting astroglial involvement in AD. Furthermore, ACEA treatment enhanced astroglial Gcl expression in both sexes, supporting the antioxidant effect of ECS-mediated neuroprotection. Altogether, the findings of this thesis support the therapeutic potential of early ECS modulation and emphasize the relevance of sex, brain-region and cell-type-specific approaches to better understand and target AD.