Development of FiCAT gene writing tool for ex vivo engineering of Hematopoietic Stem & Progenitor Cells (HSPCs). Safe implementation and detailed molecular characterization for pre-clinical therapeutic applications

Abstract

A Integra Therapeutics, hem desenvolupat FiCAT (Find and Cut-and-Transfer), una innovadora tecnologia d’edició genòmica que combina la precisió de CRISPR/Cas amb una transposasa piggyBac modificada per a la inserció eficient i específica de fragments d’ADN grans i menuts. Aquesta tesi es centra en l’aplicació ex vivo de FiCAT en cèl·lules primàries, especialment en Cèl·lules Mare i Progenitores Hematopoètiques (HSPCs), mitjançant els formats basats en ribonucleoproteïna (RNP) i ARNm. L’eina ha sigut optimitzada amb el desenvolupament de FiCAT split, separant els mòduls de la transposasa i Cas per a millorar el lliurament i l’eficiència. La validació funcional es va dur a terme mitjançant expressió del transgen (citometria de flux), PCRs de la unió per a confirmar la integració dirigida, i tècniques NGS (INSERT-seq i anàlisi d’indels). La caracterització molecular es va realitzar en línia cel·lular C2C12 abans de l’aplicació en HSPCs, on s’avaluaren eficiència i toxicitat. També es validaren càrregues terapèutiques mitjançant estratègies de gene trap. Aquest treball demostra el potencial de FiCAT per a una edició genòmica segura i precisa per a aplicacions terapèutiques.

En Integra Therapeutics, desarrollamos FiCAT (Find and Cut-and-Transfer), una tecnología de edición genómica de vanguardia que combina la precisión de CRISPR/Cas con una transposasa piggyBac modificada, para lograr una inserción eficiente y precisa de fragmentos de ADN grandes y pequeños. Esta tesis se centra en la aplicación ex vivo de FiCAT en células primarias, particularmente en Células Madre y Progenitoras Hematopoyéticas (HSPCs,), utilizando formatos de entrega de ribonucleoproteína (RNP) y ARNm. Además, optimizamos la herramienta de escritura genética mediante el desarrollo de FiCAT split, que introduce por separado los módulos de la transposasa y Cas para mejorar la entrega y la eficiencia. La validación funcional se evaluó mediante la expresión del transgen (citometría de flujo), PCR de las uniones para verificar integración dirigida y técnicas de secuenciación de nueva generación (INSERT-seq y análisis de indels). La caracterización molecular en células C2C12 precedió a su aplicación en HSPCs, donde se evaluaron la citotoxicidad y la eficiencia. También se validaron cargos terapéuticos mediante estrategias de gene trap en líneas celulares. Este trabajo demuestra el potencial de FiCAT para una edición genómica segura y precisa en HSPCs, lo que respalda su posible uso en el tratamiento de enfermedades hereditarias y el cáncer.

At Integra Therapeutics, we developed FiCAT (Find and Cut-and-Transfer), a cutting-edge genome editing technology combining CRISPR/Cas precision with an engineered piggyBac transposase for efficient and precise insertion of large and small DNA fragments. This thesis focuses on the ex vivo application of FiCAT in primary cells, particularly Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs), using ribonucleoprotein (RNP) and mRNA delivery formats. We further optimized the gene writing tool through the development of FiCAT split, separating the transposase and Cas modules to enhance delivery and efficiency. Functional validation was evaluated using transgene expression (flow cytometry), junction PCRs for on-target integration, and NGS techniques (INSERT-seq and indels analysis). Molecular characterization in C2C12 cells preceded application in HSPCs, where we assessed cytotoxicity and efficiency. Therapeutic payloads were also validated using gene trap strategies in cell lines. This work demonstrates FiCAT’s potential for safe, precise genome engineering in HSPCs, supporting its potential use in treating hereditary diseases and cancer.