Sistemas de dos componentes: Búsqueda de inhibidores, caracterización estructural y nuevos mecanismos de señalización

Abstract

En la última mitad de los años ochenta emergió el término “dos componentes” para describir una nueva clase de sistemas de transducción de señal encontrados en bacterias. Los sistemas de dos componentes (TCS) responden a múltiples estímulos, controlando a su vez una amplia variedad de procesos esenciales para la célula. El sistema prototipo consta de dos proteínas: Una histidina quinasa (HK) y un reguladora de la respuesta (RR). En general la transducción de la señal en un TCS incluye tres reacciones: la autofosforilación en un residuo de histidina específico de una HK dímerica, posteriormente este mismo grupo fosforilo es transferido a un aspartato del correspondiente RR, y finalmente el RR se desfosforila, bien por un actividad fosfatasa intrínseca o bien inducido por la HK. El nivel de fosforilación del RR altera sus propiedades transcripcionales, enzimáticas o mecanísticas. Como antes hemos dicho, los TCS están relacionados con procesos de virulencia y resistencia a antibióticos, por lo que estos sistemas constituyen una excelente diana para la búsqueda de nuevos agentes antimicrobianos. Es obvio que esta circunstancia no ha pasado desapercibida para la industria farmacéutica que ha gastado grandes sumas de dinero en la búsqueda de inhibidores para estos sistemas, habiéndose desarrollado diferentes familias de compuestos con alta actividad inhibitoria, aunque su mecanismo de acción esta mal caracterizado y es muy inespecífico, hechos que han impedido su uso terapéutico (Stephenson, K., Yamaguchi, Y. and Hoch, J.A. (2000) J. Biol. Chem. 275: 38900-38904), debido al desconocimiento del mecanismo molecular de su inhibición, además de presentar múltiples efectos secundarios. El análisis de datos estructurales existentes, de estos TCS, nos informará sobre las regiones de máxima especificidad y potencialidad de los inhibidores, y nos permitirá el rediseño de nuevas drogas más específicas. Además de en bacterias, estos TCS, también se han encontrado en otro tipo de microorganismos, como son las cianobacterias. Un espectacular ejemplo de su adaptación es el proceso de clorosis (Collier y Grossman, 1992) en el cual la pérdida de ficobilisomas y la reducción en el contenido de clorofila son las responsables de la aparición de una coloración amarilla en las poblaciones de cianobacterias. Los actores específicos incluyen una pequeña proteína NblA, uno de los principales efectores del proceso de blanqueado, y otras tres proteínas con diferentes funciones en este proceso: el regulador de la respuesta NblR, de la familia OmpR/PhoB (Schwarz y Grossman, 1998), una histidina quinasa sensora NblS (Van Waasbergen et al. 2002), y , más recientemente, el factor NblC de la familia SpoIIAB (Sendersky et al ., 2005). A pesar del hecho de que NblS y NblR fueron identificados como histidina quinasa y su regulador, no existe ninguna prueba directa de las interacciones entre ellos. Estudios de doble híbrido en Synechococcus dieron como resultado la identificación de una nueva proteína llamada SipA, que se une a la región c-terminal de NblS y de función desconocida. (Espinosa et al., 2006).

En esta tesis se presenta el siguiente trabajo:

- Cristalización y resolución de la estructura, por difracción de rayos X, de la proteína SrrB, una histidina quinasa de Staphylococcus aureus. - Búsqueda de nuevos inhibidores de histidina quinasas mediante técnicas “in silico” e “in vitro”. - Estudio de la función y participación en un sistema de dos componentes de NblS, una histidina quinasa encontrada en Cianobacterias. - Estudio de la función de SipA en los TCS y de su modulación con respecto a NblS. - Búsqueda del regulador de la respuesta de NblS mediante ensayos enzimáticos clásicos, y estudio de su función dentro de este sistema de dos componentes. - Mediante ensayos bioquímicos y de biología molecular se descarta a NblR como regulador de la respuesta de NblS.

The structural data available of the domains CA of different HK, is a valid starting point for in silico search of molecules capable of occupying the nucleotide binding site, and therefore potential inhibitors of HKs. SrrB three-dimensional structure, together with counterparts from other HKs show that the CA domain performs a rigid body motion on a conserved area to catalyze different reactions involved in the mechanism of signal transduction by TCS. NblS, the most conserved histidine kinase in cyanobacteria, regulates photosynthesis and acclimatization to a variety of environmental conditions. We used in silico, in vivo and in vitro approaches to identify RpaB and SrrA as the cognate response regulators of NblS and to characterize relevant interactions between components of this signalling system. While genetic analysis showed the importance of the NblS to RpaB phosphorylation branch for culture viability in Synechococcus elongatus PCC 7942, in vitro assays indicated a strong preference for NblS to phosphorylate SrrA. Our results provide a paradigm for regulatory interactions between response regulators in a branched two-component system. The small regulator SipA, interacts with the ATP-binding domain of NblS. We show here that SipA is a b-II class protein and that has a fold type SH3. In Synechococcus sp. PCC 7942, phycobilisome degradation and other acclimation responses after nutrient or high-light stress require activation by the orphan response regulator NblR, a member of the OmpR/PhoB family. NblR was not phosphorylated in vitro by the low-molecular-mass phosphate donor acetyl phosphate and mutation of Asp57 to Ala had no impact on previously characterized NblR functions in Synechococcus. To acknowledge the peculiarities of these atypical ‘two-component’ regulators with phosphorylation-independent signal transduction mechanisms, we propose the term PIARR, standing for phosphorylation-independent activation of response regulator.