Applications of hydroxyapatite nanoparticles in the field of biomedicine

Abstract

(English) In the biomedical field, calcium phosphates have attracted attention due to their biocompatibility and bioactivity. They can be found in different individual phases (e.g., amorphous calcium phosphate, tricalcium phosphate, tetracalcium phosphate, octacalcium phosphate and hydroxyapatite), which vary in composition, Ca/P ratio, crystalline structure, degree of substitution, and properties. Among them, carbonated-low crystallinity and highly crystalline hydroxyapatite (CHAp and HAp, respectively) have principally been used for the design of targeted drug delivery systems (DDS) and implant coatings. As the study of the CHAp and HAp nanoparticles with modified morphologies or with different ionic substituents is commonly focused on the characterization of the systems or on the general analysis of the induced biochemical response, the main objective of the thesis was to extend the knowledge of their biomolecular impact in a variety of cell lines (e.g., tumoral or osteoblastic cell lines). On the first chapter, the potential of CHAp as a carrier for doxycycline (DOX) was evaluated. The system was designed to facilitate the delivery of the antibiotic, repurposed as an antitumoral agent. Moreover, the additive effect of the constituent CHAp ions was demonstrated and the triggered changes in the proteomic and lipidomic profiles were in detail described for the first time by SR-FTIRM. The analysis of TEM micrographs helped to elucidate the morphological variations in the cells treated with CHAp or DOX- CHAp nanoparticles, providing evidence that the mineral systems induce different death mechanisms in the normal and tumoral cell lines. In order to offer a more controlled drug release and to reduce the effect of CHAp components on the normal cells, the nanoparticles were included in electrospun PLA or PLA-PEG fibers in the following chapter. Interestingly, only the PLA-PEG scaffolds allowed the release of antibiotic. In the subsequent chapter, HAp was synthesized with an urchin-like morphology. These nanoparticles were characterized and their potential role as drug carrier of gentamicin was similarly described for the first time. In addition, urchin like nanoparticles with a fluor substitution were prepared and their encapsulation efficiency compared to the values obtained with CHAp and the non-substituted urchin-like systems. The formulated carriers were originally thought as an implant coating that could help prevent the post-surgical infections that remain the principal complication of the orthopedic procedures. The newly developed systems were successfully electrodeposited on the polydopamine/collagen coated implants, followed by a final electrodeposited layer of poly-lysine.

(Català) En el camp de la biomedicina, els fosfats de calci atrauen l'atenció dels investigadors a causa de la seva biocompatibilitat i bioactivitat. Aquests minerals es poden trobar en diverses fases individuals (per exemple, el fosfat de calci amorf, el tricalci fosfat, el tetracalci fosfat, l’octocalci fosfat i la hidroxiapatita), les quals varien en la seva composició, proporció Ca/P, estructura cristal·lina, percentatge de substitució i propietats. Entre elles, la hidroxiapatita carbonatada i de baixa cristal·linitat i la hidroxiapatita altament cristal·lina (CHAp i HAp, ambdues per les seves sigles en anglès, respectivament) han estat principalment considerades per al disseny de sistemes d'administració de fàrmacs dirigits (DDS per les seves sigles en anglès) i recobriment d'implants. Pel que fa a l'estudi de les fases minerals esmentades, la investigació està comunament focalitzada en modificar la seva morfologia o variar la seva estructura química mitjançant diverses substitucions iòniques que comporten una detallada caracterització de les propietats fisicoquímiques dels sistemes. En contrast, l'efecte biològic de les nanopartícules sol limitar-se a una anàlisi bàsica de viabilitat o adherència cel·lular al biomaterial. Per aquest motiu, l'objectiu principal d'aquesta tesi va ser ampliar el coneixement sobre la resposta bioquímica de diverses línies cel·lulars (per exemple, línies tumorals i osteoblàstiques). En el primer capítol, es va estudiar el potencial de CHAp com a portador de l'antibiòtic doxiciclina (DOX). El sistema va ser dissenyat per facilitar el transport i alliberament del fàrmac, el qual va ser replantejat com a agent antitumoral. Així mateix, l'efecte additiu dels ions constituents de CHAp va ser demostrat tant en una línia normal com en una tumoral. A aquest respecte, la principal aportació d'aquesta investigació correspon a la descripció dels canvis en els perfils proteics i lipídics en ambdues línies cel·lulars mitjançant l’espectroscòpia infraroja transformada de Fourier basada en radiació de sincrotró (SR-FTIR, per les seves sigles en anglès). L'anàlisi de les micrografies obtingudes per microscòpia electrònica de transmissió (TEM, per les seves sigles en anglès) va contribuir en la determinació dels canvis morfològics induïts en les línies cel·lulars tractades amb nanopartícules de CHAp o DOX-CHAp, oferint evidència que aquests sistemes minerals desencadenen mecanismes de mort diferents i dependents del tipus cel·lular. Basant-se en aquests resultats, les nanopartícules van ser incloses en fibres de PLA o PLA-PEG electrofilades en el següent capítol. L'objectiu va ser millorar l'alliberament del fàrmac i disminuir els efectes dels ions constituents de CHAp en les línies normals. Entre ambdues, els bastides de PLA-PEG van ser els únics que van demostrar l'alliberament de l'antibiòtic. El següent capítol va ser destinat a la síntesi de HAp amb una morfologia tipus eriçó (UHAp). Simultàniament, es van elaborar nanopartícules de UHAp substituïdes amb fluor (FUHAp) i, posteriorment, es va analitzar per primera vegada el potencial d'ambdues tipologies per encapsular gentamicina i actuar com a portadores de l'antibiòtic. Els resultats van ser comparats amb els obtinguts amb CHAp. Els sistemes d'administració de gentamicina produïts van ser inicialment concebuts com a recobriments d'implants que podrien ajudar a prevenir la infecció de les estructures protètiques, la qual es manté com la principal causa de complicacions de les cirurgies ortopèdiques. Les nanopartícules van ser exitosament electrodepositades sobre implants de titani prèviament recoberts amb polidopamina i col·lagen, seguit pel recobriment amb una última capa electrodepositada de polilisina.

(Español) En el campo de la biomedicina, los fosfatos de calcio atraen la atención de los investigadores debido a su biocompatibilidad y bioactividad. Estos minerales pueden ser encontrados en diversas fases individuales (por ejemplo, el fosfato de calcio amorfo, el tricalcio de fosfato, el tetracalcio de fosfato, el octocalcio de fosfato y la hidroxiapatita), las cuales varían en su composición, proporción Ca/P, estructura cristalina, porcentaje de sustitución y propiedades. Entre ellos, la hidroxiapatita carbonatada y de baja cristalinidad y la hidroxiapatita altamente cristalina (CHAp y HAp, ambos por sus siglas en inglés, respetivamente) han sido principalmente considerados para el diseño de sistemas de administración de fármacos dirigidos (DDS por sus siglas en inglés) y recubrimiento de implantes. Respecto al estudio de las fases minerales mencionadas, la investigación está comúnmente focalizada en modificar su morfología o variar su estructura química por medio de diversas sustituciones iónicas que conllevan a una detallada caracterización de las propiedades fisicoquímicas de los sistemas. En contraste, el efecto biológico de las nanopartículas suele limitarse a un análisis básico de viabilidad o adherencia celular al biomaterial. Por este motivo, el objetivo principal de esta tesis fue ampliar el conocimiento sobre la respuesta bioquímica de diversas líneas celulares (por ejemplo; líneas tumorales y osteoblásticas). En el primer capítulo, se estudió el potencial de CHAp como carrier del antibiótico doxiciclina (DOX). El sistema fue diseñado para facilitar el transporte y liberación del fármaco, el mismo que fue replanteado como agente antitumoral. Asimismo, el efecto aditivo de los iones constituyentes de CHAp fue demostrado tanto en una línea normal como en una tumoral. Al respecto, el principal aporte de esta investigación corresponde a la descripción de los cambios en los perfiles proteicos y lipídicos en ambas líneas celulares por medio de la espectroscopia infrarroja transformada de Fourier basada en radiación de sincrotrón (SR-FTIR, por sus siglas en inglés). El análisis de las micrografías obtenidas por microscopia electrónica de transmisión (TEM, por sus siglas en inglés) contribuyó en la determinación de los cambios morfológicos inducidos en las líneas celulares tratadas con nanopartículas de CHAp o DOX- CHAp, ofreciendo evidencia de que estos sistemas minerales desencadenan mecanismos de muerte diferentes y dependientes del tipo celular. Con base a estos resultados, las nanopartículas fueron incluidas en fibras de PLA o PLA-PEG electrohiladas en el siguiente capítulo. El objetivo fue mejorar la liberación del fármaco y disminuir los efectos de los iones constituyentes de CHAp en las líneas normales. Entre ambos, los scaffolds de PLA-PEG fueron los únicos que demostraron la liberación del antibiótico. El capítulo siguiente fue destinado a la síntesis de HAp con una morfología tipo erizo (UHAp). Simultáneamente, se elaboraron nanopartículas de UHAp sustituidas con fluor (FUHAp) y, posteriormente, se analizó por primera vez el potencial de ambas tipologías para encapsular gentamicina y actuar como carriers del antibiótico. Los resultados fueron comparados con los obtenidos con CHAp. Los sistemas de administración de gentamicina producidos fueron inicialmente concebidos como recubrimientos de implantes que podrían ayudar a prevenir la infección de las estructuras protésicas, la cual se mantiene como la principal causa de complicaciones de las cirugías ortopédicas. Las nanopartículas fueron exitosamente electrodepositadas sobre implantes de titanio previamente recubiertos con polidopamina y colágeno, seguido por el recubrimiento con una última capa electrodepositada de poli-lisina.